Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

O colesterol, um dos principais lipídios celulares, desempenha numerosos papéis funcionais e estruturais críticos^{1,,2,,3,4,5,,66,7,,8,9}. Desde a regulação das propriedades físicas da membrana plasmática até a garantia da viabilidade celular, crescimento, proliferação e servindo como uma molécula de sinalização e precursora em uma infinidade de vias bioquímicas, o colesterol é um componente imperativo necessário para a função normal de células e órgãos. Como resultado, a deficiência de colesterol resulta em malformações físicas graves e uma variedade de distúrbios. Por outro lado, mesmo um pequeno aumento do colesterol acima dos níveis fisiológicos (2-3x) é citotóxico^1,2,10 e tem sido associado ao desenvolvimento de distúrbios, incluindo doenças cardiovasculares^11,,12,,13 e neurodegenerativas^14,,15,16,17. Assim, para interrogar as funções críticas do colesterol e determinar o efeito das mudanças nos níveis de colesterol, foram desenvolvidas diferentes abordagens que alteram o conteúdo do colesterol em tecidos, células e oócitos xenopus.

Alteração dos níveis de colesterol em tecidos e células de mamíferos
Várias abordagens podem ser aproveitadas para diminuir os níveis de colesterol nos tecidos e células¹⁸. Uma abordagem envolve sua exposição a estatinas dissolvidas no soro lipoproteína-deficiente para inibir a redução do HMG-CoA, que controla a taxa de síntese de colesterol^19,20. No entanto, essas drogas que reduzem o colesterol também inibem a formação de produtos não-esterol ao longo do caminho mevalonato. Portanto, uma pequena quantidade de mevalonato é adicionada para permitir a formação desses produtos²¹ e aumentar a especificidade dessa abordagem. Outra abordagem para a diminuição dos níveis de colesterol envolve o uso de β-ciclodextrinas. Estes monômeros glucopyranose possuem uma cavidade hidrofóbica interna com diâmetro que corresponde ao tamanho dos esteróis²², o que facilita a extração de colesterol das células, esgotando-os de seu teor de colesterol nativo²³. Um exemplo é a 2-hidroxipropipil-β-ciclodextrina (HPβCD), uma droga pré-clínica atualmente sendo testada para o tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C, uma desordem metabólica fatal geneticamente herdada caracterizada pelo armazenamento de colesterol lysossomal²⁴. O nível de esgotamento do colesterol depende do derivado específico utilizado. Por exemplo, o HPβCD extrai colesterol com uma capacidade menor do que o derivado metilado, metil-β-ciclodextrina (MβCD)^{24,25,26,27,28,29,30}. Notavelmente, no entanto, β-ciclodextrinas também podem extrair outras moléculas hidrofóbicas além do colesterol, o que pode resultar em efeitos inespecíficos³¹. Em contraste com o esgotamento, as células e tecidos podem ser especificamente enriquecidos com colesterol através do tratamento com β-ciclodextrina que foi pré-saturada com colesterol²³. Esta abordagem também pode ser usada como um controle para a especificidade das β-ciclodextrinas utilizadas para o esgotamento do colesterol³¹. O esgotamento do colesterol de tecidos e células é simples e pode ser alcançado expondo as células de 30-60 min a 5 mM MβCD dissolvido no meio usado para armazenar as células. Essa abordagem pode resultar em uma redução de 50% no teor de colesterol (por exemplo, em neurônios hipocampais³², artérias cerebrais de ratos³³). Por outro lado, preparar o complexo β-ciclodextrina-colesterol para o enriquecimento de colesterol de tecidos e células é mais complexo, e será descrito na seção de protocolo.

Uma abordagem alternativa para enriquecer tecidos e células que utilizam β-ciclodextrina saturada com colesterol envolve o uso de LDL, que se baseia em receptores LDL expressos nos tecidos/células¹⁸. Embora essa abordagem ofereça a vantagem de usar o maquinário de homeostase de colesterol natural da célula, ele tem várias limitações. Em primeiro lugar, tecidos e células que não expressam o receptor LDL não podem ser enriquecidos usando esta abordagem. Em segundo lugar, as partículas de LDL contêm outros lipídios, além do colesterol. Especificamente, o LDL é composto pela proteína ApoB₁₀₀ (25%) e os seguintes lipídios (75%): ~6-8% colesterol, ~45-50% éster de cholesteryl, ~18-24% fosfolipídios e ~4-8% triacilglicerols³⁴. Assim, a entrega de colesterol através de partículas LDL é inespecífica. Em terceiro lugar, o percentual de aumento do teor de colesterol por LDL em tecidos e células que expressam o receptor LDL pode ser significativamente menor do que o aumento observado usando ciclodextrina saturada de colesterol. Por exemplo, em um estudo anterior, o enriquecimento de artérias cerebrais de roedores com colesterol via LDL resultou em apenas um aumento de 10-15% nos níveis de colesterol³⁵. Em contrapartida, o enriquecimento dessas artérias com ciclodextrina saturada com colesterol conforme descrito na seção de protocolo resultou em aumento de >50% no teor de colesterol (Ver Seção Resultados Representativos, Figura 1).

Alteração dos níveis de colesterol nos oócitos xenopus
Os oócitos de xenopus constituem um sistema de expressão heterólogo comumente usado para estudar a função celular e proteica. Estudos anteriores mostraram que a razão do colesterol para o molar fosfolipídeo nos oócitos xenopus é de 0,5 ± 0,1³⁶. Devido a esse alto nível intrínseco de colesterol, o aumento do teor de colesterol neste sistema é desafiador, mas pode ser alcançado usando dispersões feitas de fosfolipídeos de membrana e colesterol. Os fosfolipídios que escolhemos para este fim são semelhantes aos utilizados para formar bicamadas lipídicas planares artificiais e incluem L-α-fosphatidyletanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), conforme descrito na seção de protocolo. Essa abordagem pode resultar em >50% de aumento no teor de colesterol (Ver seção Resultados Representativos, Figura 2).

Uma abordagem alternativa para enriquecer os oócitos xenopus com dispersões à base de fosfolipídeos envolve o uso de ciclodextrina saturada com colesterol, que é semelhante à maneira como tecidos e células são enriquecidos. No entanto, descobrimos que essa abordagem é de baixa reprodutibilidade e eficiência, com um aumento médio de ~25% no teor de colesterol. Isso possivelmente se deve à capacidade de carga diferente dessas duas abordagens (Ver seção Resultados Representativos, Figura 3). Em contraste, foi demonstrado que o uso de ciclodextrina para esgotar o colesterol dos oócitos xenopus pode resultar em uma redução de ~40% no teor de colesterol³⁶.

Aqui, focamos no enriquecimento do colesterol de tecidos e células de mamíferos através da aplicação de ciclodextrina saturada de colesterol, e de oócitos xenopus usando liposomos. Ambas as abordagens podem ser aproveitadas para delinear o efeito do aumento dos níveis de colesterol na função proteica. Os mecanismos de modulação do colesterol da função proteica podem envolver interações diretas⁸ e/ou efeitos indiretos⁹. Quando o colesterol afeta a função proteica através de interações diretas, o efeito de um aumento nos níveis de colesterol na atividade proteica é provavelmente independente do tipo celular, sistema de expressão ou abordagem de enriquecimento. Por exemplo, utilizamos essas duas abordagens para determinar o efeito do colesterol nos canais de potássio retificador interiormente (GIRK) da proteína G expressos em miócitos atrial³⁷, neurônios hipocampais^32,38, HEK293³⁹ células, e xenopus oócitos^32,37. Os resultados obtidos nestes estudos foram consistentes: em todos os três tipos de células mamíferas e em oócitos anfíbios a função de canal girk upregulated (ver seção Resultados Representativos, Figura 4, para neurônios hipocampais e os experimentos correspondentes em oócitos xenopus). Além disso, as observações feitas nesses estudos também foram consistentes com os resultados de estudos realizados em miócitos atrial^37,40 e neurônios hipocampais^32,38 recém-isolados de animais submetidos a uma dieta de colesterol elevado⁴⁰. Notavelmente, o enriquecimento do colesterol de neurônios hipocampais usando MβCD reverteu o efeito da terapia atorvastatina usada para lidar com o impacto da dieta de colesterol alto tanto nos níveis de colesterol quanto na função GIRK³⁸. Em outros estudos, investigou-se o efeito das mutações na sensibilidade ao colesterol do canal de potássio kir2.1 retificador interiormente usando tanto os oócitos de Xenopus quanto as células HEK293⁴¹. Novamente, o efeito das mutações na sensibilidade do canal foi semelhante nos dois sistemas.

As aplicações de ambos os métodos de enriquecimento para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos são numerosas. Em particular, o uso de complexos ciclodextrina-colesterol para enriquecer células e tecidos é muito comum em grande parte devido à sua especificidade. Exemplos recentes dessa abordagem incluem a determinação do impacto do colesterol na ativação do canal HERG e nos mecanismos subjacentes⁴², a descoberta de que o colesterol ativa o receptor acoplado à proteína G suavizado para promover a sinalização de Hedgehog⁴³, e a identificação do papel do colesterol na biomecânica das células-tronco e na adipogênese através das proteínas de ligação associadas à membrana⁴⁴. Em nosso próprio trabalho, utilizamos o enriquecimento de tecido mamífero com o complexo mβCD:colesterol para estudar o efeito do enriquecimento do colesterol na função básica e o perfil farmacológico dos canais de cálcio e tensão-gated de grande condutância (BK, MaxiK) no músculo liso vascular^35,45,46. Em outros estudos, utilizou-se a abordagem de dispersão baseada em fosfolipíptos para enriquecer oócitos de Xenopus com colesterol para determinar os papéis de diferentes regiões em Kir2.1 e girk na sensibilidade ao colesterol^41,47,48,49, bem como para determinar locais de ligação de colesterol putativo nesses canais^32,50,51.