Özet

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Published: March 25, 2020
doi:

Özet

Zwei Methoden der Cholesterinanreicherung werden vorgestellt: die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, um Säugetiergewebe und -zellen anzureichern, und die Verwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Diese Methoden sind entscheidend für die Bestimmung der Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in molekularen, zellulären, und Organfunktion.

Abstract

Cholesterin-Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen, einschließlich Xenopus-Oozyten, die zur Untersuchung der Zellfunktion verwendet werden, kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden. Hier beschreiben wir zwei wichtige Ansätze, die zu diesem Zweck verwendet werden. Zunächst beschreiben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem man Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, mit Zerebralen arterienden (Gewebe) und Hippocampus-Neuronen (Zellen) als Beispiele anreichert. Dieser Ansatz kann für jede Art von Gewebe, Zellen oder Zelllinien verwendet werden. Ein alternativer Ansatz für die Cholesterinanreicherung beinhaltet die Verwendung von Low-Density-Lipoprotein (LDL). Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es einen Teil der natürlichen CholesterinHomöostase-Maschinerie der Zelle verwendet. Während jedoch der Cyclodextrin-Ansatz angewendet werden kann, um jede Zellart des Interesses mit Cholesterin zu bereichern, ist der LDL-Ansatz auf Zellen beschränkt, die LDL-Rezeptoren exprimieren (z. B. Leberzellen, Knochenmark-abgeleitete Zellen wie Blutleukozyten und Gewebemakrophagen), und der Grad der Anreicherung hängt von der Konzentration und der Mobilität des LDL-Rezeptors ab. Darüber hinaus enthalten LDL-Partikel andere Lipide, so dass die Cholesterinabgabe unspezifisch ist. Zweitens beschreiben wir, wie Xenopus-Oozyten mit Cholesterin angereichert werden können, indem man eine phospholipidbasierte Dispersion (d. h. Liposomen) verwendet, die Cholesterin enthält. Xenopus Oozyten bilden ein beliebtes heterologes Expressionssystem, das zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Sowohl für den Cyclodextrin-basierten Cholesterinanreicherungsansatz von Säugetiergewebe (Zerebralenarterien) als auch für den phospholipidbasierten Cholesterinanreicherungsansatz von Xenopus Oozyten zeigen wir, dass der Cholesterinspiegel nach 5 min Inkubation ein Maximum erreicht. Dieser Cholesterinspiegel bleibt während längerer Inkubationszeiten (z.B. 60 min) konstant. Zusammen bilden diese Daten die Grundlage für optimierte zeitliche Bedingungen für die Cholesterinanreicherung von Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten für funktionelle Studien, die darauf abzielen, die Auswirkungen der Cholesterinanreicherung zu hinterfragen.

Introduction

Cholesterin, ein wichtiges zelluläres Lipid, spielt zahlreiche kritische funktionelle und strukturelle Rollen1,2,3,4,5,6,7,8,9. Von der Regulierung der physikalischen Eigenschaften der Plasmamembran bis hin zur Sicherstellung der Zelllebensfähigkeit, des Wachstums, der Proliferation und der Funktion als Signal- und Vorläufermolekül in einer Vielzahl biochemischer Bahnen ist Cholesterin ein zwingender Bestandteil, der für die normale Zell- und Organfunktion notwendig ist. Als Ergebnis, Cholesterinmangel führt zu schweren körperlichen Fehlbildungen und eine Vielzahl von Störungen. Auf der anderen Seite, auch eine kleine Erhöhung des Cholesterins über physiologischen Niveaus (2-3x) ist zytotoxisch1,2,10 und wurde mit der Entwicklung von Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf11,12,13 und neurodegenerative Erkrankungen14,15,16,17verbunden. Um die kritischen Funktionen des Cholesterins zu hinterfragen und die Wirkung von Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die den Cholesteringehalt in Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten verändern.

Veränderung des Cholesterinspiegels in Säugetiergeweben und -zellen
Mehrere Ansätze können genutzt werden, um den Cholesterinspiegel in Geweben und Zellen18zu senken. Ein Ansatz beinhaltet ihre Exposition gegenüber Statinen, die in Lipoprotein-defizigem Serum gelöst werden, um HMG-CoA-Reduktase zu hemmen, die die Rate der Cholesterinsynthesesteuert 19,20. Jedoch, Diese Cholesterin senkenden Medikamente hemmen auch die Bildung von Nicht-Sterol-Produkte entlang der Mevalonat-Weg. Daher wird eine kleine Menge Mevalonat hinzugefügt, um die Bildung dieser Produkte zu ermöglichen21 und die Spezifität dieses Ansatzes zu verbessern. Ein weiterer Ansatz zur Senkung des Cholesterinspiegels beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrinen. Diese Glucopyranose-Monomere besitzen eine interne hydrophobe Höhle mit einem Durchmesser, der der Größe der Sterole22entspricht, was die Extraktion von Cholesterin aus Zellen erleichtert und sie dadurch von ihrem nativen Cholesteringehalt23erschöpft. Ein Beispiel ist 2-Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HP-CD), ein präklinisches Medikament, das derzeit zur Behandlung der Niemann-Pick-Typ-C-Krankheit getestet wird, einer genetisch vererbten tödlichen Stoffwechselstörung, die durch lysosomale Cholesterinspeicherung gekennzeichnet ist24. Der Grad des Cholesterinmangels hängt von dem verwendeten spezifischen Derivat ab. Zum Beispiel extrahiert HP-CD Cholesterin mit einer geringeren Kapazität als das methylierte Derivat, Methyl-A-Cyclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Vor allem aber können neben Cholesterin auch andere hydrophobe Moleküle extrahiert werden, die dann zu unspezifischen Wirkungen führen können31. Im Gegensatz zur Erschöpfung können Zellen und Gewebe durch die Behandlung mit dem mit Cholesterin23vorgesättigten A-Cyclodextrin gezielt mit Cholesterin angereichert werden. Dieser Ansatz kann auch als Kontrolle für die Spezifität von ,,Cyclodextrinen” verwendet werden, die für den Cholesterinmangel verwendet werden31. Der Abbau von Cholesterin aus Geweben und Zellen ist einfach und kann erreicht werden, indem die Zellen für 30-60 min bis 5 mM M’CD in dem Medium, das für die Lagerung der Zellen verwendet wird, gelöst werden. Dieser Ansatz kann zu einer 50%igen Abnahme des Cholesteringehalts führen (z.B. in Hippocampus-Neuronen32, Rattenhirnarterien33). Auf der anderen Seite ist die Vorbereitung des “Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexes” für die Cholesterinanreicherung von Gewebe und Zellen komplexer und wird im Protokollabschnitt beschrieben.

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit mit Cholesterin gesättigtem X-Cyclodextrin beinhaltet die Verwendung von LDL, das auf LDL-Rezeptoren beruht, die in den Geweben/Zellen18exprimiert werden. Während dieser Ansatz bietet den Vorteil der Verwendung der natürlichen Cholesterin Homöostase Maschinerie der Zelle, Es hat mehrere Einschränkungen. Erstens können Gewebe und Zellen, die den LDL-Rezeptor nicht ausdrücken, mit diesem Ansatz nicht angereichert werden. Zweitens enthalten LDL-Partikel neben Cholesterin auch andere Lipide. Insbesondere besteht LDL aus dem Protein ApoB100 (25%) und die folgenden Lipide (75%): 6-8% Cholesterin, 45-50% Cholesterylester, 18-24% Phospholipide und 4-8% Triacylglycerole34. Daher ist die Abgabe von Cholesterin über LDL-Partikel unspezifisch. Drittens kann der prozentuale Anstieg des Cholesteringehalts durch LDL in Geweben und Zellen, die den LDL-Rezeptor ausdrücken, signifikant niedriger sein als der Mit dem Cholesteringehalt beobachtete Anstieg. Zum Beispiel, in einer früheren Studie, Anreicherung von Nagetier Hirnarterien mit Cholesterin über LDL führte nur zu einem 10-15% Anstieg des Cholesterinspiegels35. Im Gegensatz dazu führte die Anreicherung dieser Arterien mit Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, wie im Protokollabschnitt beschrieben, zu einer >50%igen Erhöhung des Cholesteringehalts (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).

Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten
Xenopus Oozyten bilden ein heterologes Expressionssystem, das häufig zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Cholesterin-Zu-Phospholipid-Molaren-Verhältnis in Xenopus-Oozyten 0,5 x 0,136beträgt. Aufgrund dieses intrinsischen hohen Cholesterinspiegels ist die Erhöhung des Cholesterinspiegels in diesem System eine Herausforderung, kann aber mit Dispersionen aus Membranphospholipiden und Cholesterin erreicht werden. Die Phospholipide, die wir für diesen Zweck gewählt haben, ähneln denen, die zur Bildung künstlicher planarer Lipid-Doppelschichten verwendet werden, und umfassen L-A-Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), wie im Protokollabschnitt beschrieben. Dieser Ansatz kann zu >50% Anstieg des Cholesteringehalts führen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2).

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit phospholipidbasierten Dispersionen beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, was der Art und Weise ähnelt, wie Gewebe und Zellen angereichert werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass dieser Ansatz von geringer Reproduzierbarkeit und Effizienz ist, mit einem durchschnittlichen Anstieg des Cholesteringehalts um 25 %. Dies ist möglicherweise auf die unterschiedliche Belastbarkeit dieser beiden Ansätze zurückzuführen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 3). Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Cyclodextrin, um Cholesterin aus Xenopus Oozyten zu erschöpfen, zu einer Abnahme des Cholesteringehalts um 40 % führen kann36.

Hier konzentrieren wir uns auf die Cholesterinanreicherung von Säugetiergeweben und -zellen durch die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, und von Xenopus Oozyten mit Liposomen. Beide Ansätze können genutzt werden, um die Wirkung eines erhöhten Cholesterinspiegels auf die Proteinfunktion abzuleiten. Die Mechanismen der Cholesterinmodulation der Proteinfunktion können direkte Wechselwirkungen8 und/oder indirekte Effektebeinhalten 9. Wenn Cholesterin die Proteinfunktion über direkte Wechselwirkungen beeinflusst, ist die Wirkung eines Anstiegs des Cholesterinspiegels auf die Proteinaktivität wahrscheinlich unabhängig vom Zelltyp, Expressionssystem oder Anreicherungsansatz. Zum Beispiel nutzten wir diese beiden Ansätze, um die Wirkung von Cholesterin auf G-Protein-Gated-Innen-Rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRK) zu bestimmen, ausgedrückt in Vorhoffnden Myozyten37, Hippocampus-Neuronen32,38, HEK29339 Zellen und Xenopus-Oozyten 32,37. Die in diesen Studien erzielten Ergebnisse waren konsistent: in allen drei Arten von Säugetierzellen und in Amphibien-Oozyten wurde die GIRK-Kanalfunktion von Cholesterin hochreguliert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4, für Hippocampus-Neuronen und die entsprechenden Experimente in Xenopus-Oozyten). Darüber hinaus stimmten die in diesen Studien gemachten Beobachtungen auch mit den Ergebnissen von Studien überein, die an den Vorhofmyozyten37,40 und hippocampalneuronen32,38 frisch isoliert von Tieren, die einer hohen Cholesterindiät ausgesetztwaren, 40durchgeführt wurden. Bemerkenswert ist, dass die Cholesterinanreicherung von Hippocampus-Neuronen mit M-CD die Wirkung der Atorvastatin-Therapie, die zur Bekämpfung der Auswirkungen der hohen Cholesterin-Diät sowohl auf den Cholesterinspiegel als auch auf die GIRK-Funktionverwendetwird, umkehrte. In anderen Studien untersuchten wir die Wirkung von Mutationen auf die Cholesterinempfindlichkeit des nach innen korrigierenden Kaliumkanals Kir2.1 mit Xenopus-Oozyten und HEK293-Zellen41. Auch hier war die Wirkung der Mutationen auf die Empfindlichkeit des Kanals in den beiden Systemen ähnlich.

Die Anwendungen beider Anreicherungsmethoden zur Bestimmung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinspiegel auf die Molekular-, Zell- und Organfunktion sind zahlreich. Insbesondere die Verwendung von Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexen zur Anreicherung von Zellen und Geweben ist aufgrund seiner Spezifität sehr häufig. Jüngste Beispiele für diesen Ansatz sind die Bestimmung der Auswirkungen von Cholesterin auf herG-Kanalaktivierung und zugrunde liegende Mechanismen42, die Entdeckung, dass Cholesterin aktiviert die G-Protein gekoppelt Rezeptor Geglättet, um Hedgehog Signalisierung43zu fördern , und die Identifizierung der Rolle von Cholesterin in Stammzell Biomechanik und Adipogenese durch Membran-assoziierte Linker Proteine44. In unserer eigenen Arbeit nutzten wir die Anreicherung von Säugetiergewebe mit dem M-CD:Cholesterin-Komplex, um die Wirkung der Cholesterinanreicherung auf die Grundfunktion und das pharmakologische Profil von Kalzium- und Spannungskanälen großer Leitfähigkeit (BK, MaxiK) im vaskulären Glattmuskel35,45,46zuuntersuchen. In anderen Studien verwendeten wir den Phospholipid-basierten Dispersionsansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin, um die Rollen verschiedener Regionen in Kir2.1- und GIRK-Kanälen in der Cholesterinempfindlichkeit41,47,48,49, sowie zur Bestimmung vermeintlicher Cholesterinbindungsstellen in diesen Kanälen32,50,51zubestimmen.

Protocol

Alle experimentellen Eingriffe mit Tieren wurden am University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) durchgeführt. Die Pflege von Tieren und Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des UTHSC überprüft und genehmigt, einer Einrichtung, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert ist. 1. Anreicherung von Geweben und Zellen mit methyl–cyclodextrin gesättigt mit Cholesterin HIN…

Representative Results

Die Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem Cyclodextrin als Mittel zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit Cholesterin ist etabliert. Hier zeigen wir zunächst die Anwendung dieses weit verbreiteten Ansatzes zur Anreicherung von Rattenhirnarterien mit Cholesterin unter Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem M-CD. Abbildung 1zeigt ein Beispiel für eine abgebildete zerebrale Arterie glatte Muskelschicht und zeigt die konzentratio…

Discussion

Methoden zur Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin bilden ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinwerte auf einzelne molekulare Arten, auf komplexe makromolekulare Systeme (z. B. Proteine) und auf die Zell- und Organfunktion. In diesem Beitrag haben wir zwei komplementäre Ansätze beschrieben, die solche Studien erleichtern. Zuerst beschrieben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem wir mit Cholester…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Scientist Development Grant (11SDG5190025) der American Heart Association (zu A.R.-D.) und durch das National Institute of Health R01 Zuschüsse AA-023764 (bis A.N.B.) und HL-104631 und R37 AA-11560 (bis A.M.D.) unterstützt.

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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