Verrijking van zoogdierweefsels en Xenopus-eicyten met cholesterol

Cholesterol, een belangrijke cellulaire lipide, speelt tal van kritische functionele en structurele rollen^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. Van het reguleren van de fysische eigenschappen van het plasmamembraan tot het waarborgen van de levensvatbaarheid van de cel, groei, proliferatie en het dienen als een signalering en voorlopermolecuul in een overvloed aan biochemische paden, cholesterol is een dwingende component die nodig is voor de normale cel- en orgaanfunctie. Als gevolg daarvan, cholesteroltekort resulteert in ernstige fysieke misvormingen en een verscheidenheid van aandoeningen. Aan de andere kant is zelfs een kleine stijging van cholesterol boven fysiologischniveau (2-3x) cytotox^1,2,10 en is geassocieerd met de ontwikkeling van aandoeningen, waaronder cardiovasculaire^11,,12,13 en neurodegeneratieve ziekten^14,15,16,17. Dus, om de kritische functies van cholesterol te ondervragen en om het effect van veranderingen in het cholesterolgehalte te bepalen, zijn verschillende benaderingen ontwikkeld die het gehalte aan cholesterol in weefsels, cellen en Xenopus-eicellen veranderen.

Wijziging van het cholesterolgehalte in weefsels en cellen van zoogdieren
Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt om het cholesterolgehalte in weefsels en cellen te verlagen¹⁸. Een benadering omvat hun blootstelling aan statines opgelost in lipoprotaire-deficiënte serum te remmen HMG-CoA reductase, die de snelheid van cholesterolsynthese controles^19,20. Echter, deze cholesterolverlagende geneesmiddelen remmen ook de vorming van niet-sterol producten langs de mevalonaat pad. Daarom wordt een kleine hoeveelheid mevalonaat toegevoegd om de vorming van deze producten²¹ mogelijk te maken en de specificiteit van deze aanpak te verbeteren. Een andere benadering voor het verlagen van het cholesterolgehalte omvat het gebruik van β-cyclodextrines. Deze glucopyranose monomeren bezitten een interne hydrofobe holte met een diameter die overeenkomt met de grootte van sterolen²², die de extractie van cholesterol uit cellen vergemakkelijkt, waardoor ze uit hun eigen cholesterolgehalte²³. Een voorbeeld is 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPβCD), een preklinisch geneesmiddel dat momenteel wordt getest voor de behandeling van de Niemann-Pick type C-ziekte, een genetisch erfelijke fatale stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door lysosomale cholesterolopslag²⁴. Het niveau van cholesterol uitputting is afhankelijk van de specifieke afgeleide gebruikt. Zo haalt HPβCD cholesterol met een lagere capaciteit dan het gemethyleerde derivaat, methyl-β-cyclodextrine (MβCD)^{24,25,26,27,28,29,30}. Met name kunnen β-cyclodextrines echter naast cholesterol ook andere hydrofobe moleculen extraheren, wat dan kan leiden tot niet-specifieke effecten³¹. In tegenstelling tot uitputting kunnen cellen en weefsels specifiek worden verrijkt met cholesterol door behandeling met β-cyclodextrine die is voorverzadigd met cholesterol²³. Deze aanpak kan ook worden gebruikt als een controle voor de specificiteit van β-cyclodextrines die worden gebruikt voor cholesteroluitputting³¹. Uitputting van cholesterol uit weefsels en cellen is eenvoudig en kan worden bereikt door het blootstellen van de cellen voor 30-60 min tot 5 mM MβCD opgelost in het medium dat wordt gebruikt voor het opslaan van de cellen. Deze aanpak kan resulteren in een 50% afname van het cholesterolgehalte (bijvoorbeeld in hippocampalneuronen³², rat cerebrale slagaders³³). Aan de andere kant, de voorbereiding van de β-cyclodextrine-cholesterol complex voor cholesterolverrijking van weefsel en cellen is complexer, en zal worden beschreven in het protocol sectie.

Een alternatieve benadering voor het verrijken van weefsels en cellen met β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol omvat het gebruik van LDL, dat is gebaseerd op LDL-receptoren uitgedrukt in de weefsels/cellen¹⁸. Hoewel deze aanpak biedt het voordeel van het gebruik van de natuurlijke cholesterol homeostase machines van de cel, het heeft verschillende beperkingen. Ten eerste kunnen weefsels en cellen die de LDL-receptor niet uitdrukken, niet worden verrijkt met deze aanpak. Ten tweede bevatten LDL-deeltjes naast cholesterol ook andere lipiden. LdL bestaat met name uit het eiwit ApoB₁₀₀ (25%) en de volgende lipiden (75%): ~6-8% cholesterol, ~45-50% cholesterylester, ~18-24% fosfolipiden, en ~4-8% triacylglycerols³⁴. De levering van cholesterol via LDL-deeltjes is dus niet specifiek. Ten derde kan het percentage van de toename van het cholesterolgehalte door LDL in weefsels en cellen die de LDL-receptor uitdrukken aanzienlijk lager zijn dan de waargenomen toename met cyclodextrine verzadigd met cholesterol. Bijvoorbeeld, in een eerdere studie, verrijking van knaagdieren cerebrale slagaders met cholesterol via LDL resulteerde in slechts een 10-15% stijging van het cholesterolgehalte³⁵. Daarentegen resulteerde de verrijking van deze slagaders met cyclodextrine verzadigd met cholesterol zoals beschreven in de protocolsectie in >50% verhoging van het cholesterolgehalte (zie sectie Representatieve resultaten, figuur 1).

Wijziging van het cholesterolgehalte in Xenopus-eicellen
Xenopus-eicellen vormen een heterolog expressiesysteem dat vaak wordt gebruikt voor het bestuderen van de cel- en eiwitfunctie. Eerdere studies hebben aangetoond dat de cholesterol tot fosfolipide molaire verhouding in Xenopus-eicellen 0,5 ± 0,1³⁶is. Vanwege dit intrinsieke hoge cholesterolgehalte is het verhogen van het cholesterolgehalte in dit systeem een uitdaging, maar kan worden bereikt met behulp van dispersies gemaakt van membraanfosfolipiden en cholesterol. De fosfolipiden die we hiervoor hebben gekozen zijn vergelijkbaar met die welke worden gebruikt voor de vorming van kunstmatige vlakke lipide bilagen en omvatten L-α-phosphatidylethanolamine (POPE) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), zoals beschreven in de protocolsectie. Deze aanpak kan resulteren in >50% verhoging van het cholesterolgehalte (Zie representatieve resultaten sectie, figuur 2).

Een alternatieve benadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen met op fosfolipiden gebaseerde dispersies omvat het gebruik van cyclodextrine verzadigd met cholesterol, wat vergelijkbaar is met de manier waarop weefsels en cellen worden verrijkt. Echter, we hebben gevonden deze aanpak te zijn van lage reproduceerbaarheid en efficiëntie, met een gemiddelde van ~ 25% toename van het cholesterolgehalte. Dit is mogelijk te wijten aan de verschillende laadcapaciteit van deze twee benaderingen (Zie representatieve resultaten, figuur 3). In tegenstelling, het is aangetoond dat het gebruik van cyclodextrine om cholesterol uit Xenopus eicellen uit te putten kan resulteren in een ~ 40% daling van het cholesterolgehalte³⁶.

Hier richten we ons op cholesterolverrijking van zoogdierweefsels en -cellen door de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol, en van Xenopus-eicellen met liposomen. Beide benaderingen kunnen worden gebruikt om het effect van verhoogde niveaus van cholesterol op eiwitfunctie af te bepalen. De mechanismen van cholesterolmodulatie van de eiwitfunctie kunnen directe interacties⁸ en/of indirecte effecten omvatten⁹. Wanneer cholesterol de eiwitfunctie beïnvloedt via directe interacties, is het effect van een verhoging van het cholesterolgehalte op eiwitactiviteit waarschijnlijk onafhankelijk van het celtype, expressiesysteem of verrijkingsbenadering. Bijvoorbeeld, we gebruikten deze twee benaderingen om het effect van cholesterol op G-eiwit gated naar binnen gating kalium (GIRK) kanalen uitgedrukt in atrium myocyten³⁷, hippocampal neuronen^32,38, HEK293³⁹ cellen, en Xenopus eicellen^32,37. De resultaten van deze studies waren consistent: in alle drie de soorten zoogdiercellen en in amfibie-eicellen werd de gereglementeerde GIRK-kanaalfunctie (zie sectie Representatieve resultaten, figuur 4, voor hippocampalneuronen en de overeenkomstige experimenten in Xenopus-eicyten). Bovendien kwamen de waarnemingen in deze studies ook overeen met de resultaten van studies uitgevoerd bij atriummyocyten^37,,40 en hippocampalneuronen^32,38 vers geïsoleerd van dieren die onderworpen zijn aan een hoog cholesterolgehalte dieet⁴⁰. Met name, cholesterolverrijking van hippocampal neuronen met behulp van MβCD omgekeerd het effect van atorvastatine therapie gebruikt voor het aanpakken van de impact van het hoog cholesteroldieet zowel op het cholesterolgehalte en GIRK functie³⁸. In andere studies onderzochten we het effect van mutaties op de cholesterolgevoeligheid van het naar binnen gaan corrigerende kaliumkanaal Kir2.1 met behulp van zowel Xenopus-eicellen als HEK293-cellen⁴¹. Nogmaals, het effect van de mutaties op de gevoeligheid van het kanaal was vergelijkbaar in de twee systemen.

De toepassingen van beide verrijkingsmethoden voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus op moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie zijn talrijk. In het bijzonder, het gebruik van cyclodextrine-cholesterol complexen om cellen en weefsels te verrijken is zeer gebruikelijk grotendeels te wijten aan de specificiteit. Recente voorbeelden van deze aanpak zijn de bepaling van de impact van cholesterol op herg kanaal activering en onderliggende mechanismen⁴², de ontdekking dat cholesterol activeert de G-eiwit gekoppelde receptor Gladgestreken ter bevordering van Hedgehog signalering⁴³, en de identificatie van de rol van cholesterol in stamcelbiomechanica en adipogenese door middel van membraan-geassocieerde linker eiwitten⁴⁴. In ons eigen werk gebruikten we weefselverrijking van zoogdieren met het MβCD:cholesterolcomplex om het effect van cholesterolverrijking op de basisfunctie en het farmacologische profiel van calcium- en voltage-gated kanalen van grote geleiding (BK, MaxiK) in vasculaire gladde spier^35,45,,46te bestuderen. In andere studies gebruikten we de op fosfolipiden gebaseerde dispersiebenadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen met cholesterol om de rollen van verschillende regio’s in Kir2.1- en GIRK-kanalen in cholesterolgevoeligheid^41,47,,49te bepalen, evenals om vermeende cholesterolbindende plaatsen in deze kanalen^32,50,51te bepalen.⁴⁸