제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

동물과 관련된 모든 작업은 윌리엄과 메리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 승인 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 동물 관리 및 배아 취급 인간 융모성 생식샘 자극호르몬(HCG)의 피하 주사를 성인 제노푸스 라에비스의 등쪽 림프낭에 투여하여 여성의 경우 600 U, 남성의 경우 400 U를 투여하여 자연스러운 짝짓기를 유도한다. 주입 후, 하룻밤 동안 실온 보유 탱크에 적어도 한 명의 수컷과 한 명의 암컷 개구리를 놓는다. 계란 누워 는 일반적으로 HCG 투여 후 9-12 h를 시작합니다. 배아를 수집합니다. 2% 시스테인(pH 8.0)으로 2-4분간 부드럽게 세척하여 데젤리를 드넬리. 배아를 0.1x 마크의 변형 링거 용액(MMR)(100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4,2 mM CaCl2,5 mM HEPES, pH 7.4-7.6으로 조정)으로 헹구다. 배아를 0.1x MMR 및 50 μg/mL 젠타마이신을 함유한 100 mm 유리 페트리 접시로 옮긴다. 판당 50-100개의 배아의 밀도가 적절하다. 14 °C-22 °C에서 접시를 배양하고 배아가 원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 발전 할 수 있도록하십시오. 주기적으로 플라스틱 전달 파이펫으로 비옥한 세포와 괴사 또는 비정상적으로 발달하는 배아를 제거합니다.참고: 일관성을 보장하기 위해 Nieuwkoop 및 Faber16에의해 정의된 형태학적 기준에 따라 개발 스테이징이 수행됩니다. 관심 단계는 실험적 초점에 따라 달라집니다. 예를 들어, 주요 신경 발달 랜드 마크는 단계 와 관련 된 14 (신경 의 발병), 단계 18 (신경 관 폐쇄의 발병), 그리고 단계 22 (테일 버드 신장의 발병). 2. 배아 해부 및 샘플 준비 솔루션 준비 116 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O,1.31 mM MgSO4,4.6 mM 트리스를 포함하는 2 mMCa2+ 용액을 준비합니다. 100 mL 용액마다 페니실린/스트렙토마이신 1mL(10,000 U/mL 페니실린; 10,000 μg/mL 스트렙토마이신)를 추가합니다. pH를 7.8로 조정하고 필터 멸균합니다. 116 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 4.6 mM 트리스 및 0.4 mM EDTA를 결합하여 칼슘 및 마그네슘이없는 (CMF) 용액을 준비하십시오. pH를 7.8로 조정하고 오토클레이브를 사용하여 살균합니다. 100 mL 용액마다 페니실린/스트렙토마이신 1mL(10,000 U/mL 페니실린; 10,000 μg/mL 스트렙토마이신)를 추가합니다. pH를 7.8로 조정하고 필터 멸균합니다. 해부 및 이미징용 플레이트 준비 UV 살균 2 35mm 플라스틱 페트리 접시와 1 개의 35mm 세포 배양 접시 (재료 표참조). 층류 후드에서 작업하는 동안 각각 2mM Ca 2+ 용액 10 mL을 포함하는 2 개의 50 mL 플라스틱 원유튜브를 준비하십시오. 층류 후드에서 계속 작업하고 35mm 플라스틱 페트리 접시 하나에 2 mL의 2 mL을 추가, 하나의 35mm 세포 배양 접시에 2 mMCa2+ 용액, 하나의 35mm 플라스틱 페트리 접시에 CMF 용액 2 mL. 층류 후드 의 외부, 젠타 마이신 (50 μg / mL)와 0.1x MMR와 두 개의 100mm 플라스틱 페트리 접시와 하나의 35mm 플라스틱 페트리 접시를 채웁니다. 70% 에탄올로 60mm 플라스틱 페트리 접시를 채웁니다. 해부 직전에, 0.01 g의 콜라게나아제 B를Ca2+ 용액을 함유한 50 mL 튜브 중 하나에 넣습니다. 잘 섞어서 용액을 신선한 60mm 플라스틱 페트리 접시에 옮김을 옮김. 해부 현미경의 도움으로 원하는 발달 단계의 배아를 식별하십시오. 멸균 전사 파이펫을 사용하여 2.2.4단계에서 제조된 0.1x MMR+ 젠타마이신을 함유하는 100 mm 플레이트 중 하나에 적어도 6개의 적절한 배아를 이송한다. 이것은 홀딩 플레이트역할을 할 것이다. 멸균 전사 파이펫을 사용하여 1개의 배아를 0.1x MMR + 젠타마이신을 함유하는 두 번째 100 mm 플레이트로 옮김을 옮김을 사용한다. 이것은 해부 판역할을 할 것이다. 배아를 충분히 해부하는 경우(약 23단계 이상), 0.1% 3-아미노벤조산 에틸 에스테르를 함유한 접시에 젠타마이신(50 μg/mL)으로 희석한 접시로 옮겨 해부하기 전에 각 배아를 마취시금한다. 배아가 움직이지 않게 되면, 젠타마이신(50 μg/mL)으로 0.1x MMR을 함유한 접시로 다시 옮기고 해부를 계속한다. 배아를 둘러싸는 비텔린 막을 조심스럽게 제거하십시오. 이것은 막을 잡기 위하여 정밀한 집게의 쌍을 사용하는 동안 태아를 안정시키기 위하여 무딘 집게의 쌍을 사용하여 가장 쉽게 할 수 있습니다. 미세한 집게로 조심스럽게 당겨 비텔린 멤브레인을 벗겨냅니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 배아의 등지와 복부 영역을 분리 합니다. 이것은 전방 후방 축을 따라 배아를 ‘꼬집기’로 집게하여 반으로 절단함으로써 수행 할 수 있습니다. 멸균 전사 파이펫을 사용하여 등쪽 부분을 2.2.5단계에서 제조된 콜라게나제 용액으로 60mm 플레이트에 옮김을 전달합니다. 복부 부분을 폐기하십시오. 등쪽 이식이 실온에서 1-2 분 동안 콜라겐 액에 배양되도록하십시오. 부드럽게 해부 플레이트에 다시 전송합니다. 외배엽의 추정 신경 조직에서 모든 잔류 내피 및 중피 오염을 조심스럽게 제거하여 해부를 완료하십시오. 단계 22 이상에 배아를 위해, 신경관은 또한 제거하고 폐기되어야 합니다.참고: 해부 중에 필요한 경우, 2.2.4단계에서 제조된 70% 에탄올의 접시를 집게를 치우거나 재살균하는데 사용할 수 있다. 해부가 완료되면, 2.2.3 단계에서 제조된Ca2+ 용액의 35 mm 플레이트로 부드럽게 이식을 전달한다. 4개의 이식이 수집될 때까지 2.4-2.9단계를 반복합니다. P1000 마이크로파이펫을 사용하여 4개의 이식을 CMF 용액을 함유한 35mm 플레이트로 옮기고, 이식과 공기-물 인터페이스 사이의 접촉을 방지하십시오. 접시의 중앙에 모든 이식 클러스터되도록 부드럽게 접시를 소용돌이. 이식이 해리될 수 있도록 실온에서 1h를 배양합니다.참고 : 해리를 돕기 위해 0.025 % – 0.01 % 트립신을 CMF 솔루션에 첨가 할 수 있습니다. 이것은 오래된 태아의 능률적인 해리를 위해 필요할 지도 모릅니다 (단계 22 이상). 이 시점에서, 적어도 2 개의 적절 하 게 준비 된 배아 보유 플레이트에 남아 있어야 합니다. 이 배아를 2.2.4 단계에서 준비된 젠타마이신으로 0.1x MMR로 채워진 신선한 접시로 옮기고 이식 접시에 맞게 덮인 접시로 방해받지 않고 개발할 수 있도록 하십시오. 이 태아는 형제 통제로 봉사할 것입니다. 2.2.3단계에서 제조된 35mm 셀 배양 접시의 바닥에 마이크로 룰커버슬립(재료 표참조)을 부착하기 위해 수퍼글루를 사용하십시오.참고: 커버슬립 가장자리에 작은 수퍼글루를 두드린 다음 셀 배양 접시의 밑면에 단단히 누릅니다. 위치 표시는 접착제가 그리드에 닿는 곳이면 어디든 가려지므로 커버슬립의 중앙 격자 부분을 접착제로부터 멀리 하는 것이 중요합니다. 이식이 1시간 동안 해리된 후, P100 마이크로파이펫을 사용하여 세포 배양 접시로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 사용한다. 접시의 격자 부분에 가능한 한 많은 셀을 플레이트하기 위해, 접시의 표면에 가까운 얕은 각도로 파이펫을 잡고, 파이펫 팁을 안쪽을 향한 격자의 모서리에 배치하고, 단단히 격자 아르에 걸쳐 셀 현탁액을 추방 ea. 이상적으로, 세포는 단단한 조밀한 클러스터에서 정착할 것입니다. 실온에서 1 시간 동안 배양하여 세포가 플레이트에 부착 될 수 있도록합니다. 이 배양이 시작될 때 형제 대조군 배아의 발달 단계를 결정하고 기록합니다. 5 μL 1 mM 플루오-4 AM (재료 표참조)과 10 % 플루론F-127 산의 2 μL을 결합하십시오.참고: Fluo-4 AM은 가볍고 민감하며 항상 가벼운 안전 또는 호일로 덮인 튜브에 보관해야 합니다. 배양이 완료된 후 샘플 접시를 암실 또는 기타 조명 보호 위치로 옮습니다. 마이크로파이펫을 사용하여 접시 가장자리에서 용액 100 μL을 제거합니다. 이 용액을 Fluo-4 AM/Pluronic F-127 산의 양치에 추가하고 파이펫을 위아래로 섞고 전체 부피를 샘플 접시에 반환합니다. 부드럽게 소용돌이섞으세요. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 이 배양이 시작될 때 형제 대조군 배아의 발달 단계를 결정하고 기록합니다. 배양의 끝에서, 다음과 같은 방법으로 세 가지 매체 세척을 수행하기 위해 2mMCa2 +의 나머지 원추형 튜브를 사용하여 : 1) 접시에서 용액 1 mL을 제거하고, 신선한 용액의 3 mL을 추가하고, 3) 접시에서 3 mL의 용액을 제거하고, 3) 접시에서 3 mL의 용액을 제거하고, 3 mL의 신선한 용액을 추가하십시오. 3. 칼슘 이미징 참고: 칼슘 이미징은 거꾸로 된 공초점현미경(물자 표)을사용하여 수행하였다. 현미경 단계에 견본 격판을 놓고, 주위 빛 노출에서 그것을 보호하기 위하여 주의를 기울이기. 플레이트가 고정되면 마커를 사용하여 플레이트의 전면 점에 라벨을 부착하여 후속 이미징에서 동일한 시야를 찾을 수 있도록 합니다. 현미경으로 샘플을 찾은 다음 먼저 10X에서 20배 배율로 시료를 찾고 이미징에 적합한 시야를 선택합니다. 이상적인 시야는 세포 밀도가 높지만 세포가 뭉치거나 개별적으로 구별하기 어렵기 때문에 밀도가 높지 않습니다. 격자 지배 커버슬립이 보이게 되도록 현미경 초점을 조정합니다. 커버슬립에 표시된 숫자는 특정 그리드 궤적에 대한 고유 식별자로 사용되며 추가 이미징을 위해 동일한 시야를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 원래 선택한 뷰 필드가 숫자와 겹치지 않으면 식별 가능한 숫자가 프레임에 있을 때까지 다시 정의합니다. 그리드 가형 커버슬립에 초점을 맞추어 선택한 시야의 밝은 필드 이미지를 찍습니다. 초점 설정을 조정하고 셀이 포커스를 조정하여 선택한 시야의 밝은 필드 이미지를 찍습니다. 세포 층에 초점을 맞추어 488 nm 레이저로 샘플을 조명합니다. 각 실험에 대해 HV 및 오프셋 값을 최적화하여 FITC 채널에서 동적 형광 범위가 감지되도록 할 수 있습니다. 2시간 이미지의 경우 이미징 구성을 수정하여 스캔 시간이 3.93s이고 간격이 8s로 901프레임을 기록하여 이미지를 획득합니다. 이미징이 완료되면 현미경 단계에서 플레이트를 제거하십시오. 플레이트에서 용액 1 mL을 제거하고 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA 및 7.4 % 포름 알데히드에서 2 mM MgSO4)의 1 mL로 교체하십시오. 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양이 시작될 때 형제 대조군 배아의 발달 단계를 결정하고 기록합니다. 고정이 완료된 후 플레이트에서 모든 용액을 제거하고 1x PBS 의 2 mL로 교체하십시오. 추가 처리를 위해 플레이트를 4°C에서 보관하십시오. 4. 유전자 발현 분석 : 프로브 합성 하기보다 설명한 바와 같이, 옥시 혼성화에 대한 안티센스 RNA 프로브를 생성한다. 부가적으로, 음성 대조군으로 사용하기 위해 동일한 유전자에 대한 센스 프로브를 생성한다. 프로브 템플릿 서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 정화하기 위해, 템플릿 플라스미드를 함유하는 세균성 글리세롤 스톡으로 LB 국물 150 mL을 접종하였다. 37°C에서 밤새 또는 배양이 혼탁될 때까지 흔들어 서 배양합니다. 당신의 선택 방법을 사용하여 세균 배양에서 플라스미드 DNA를 정화하십시오.참고 : 우리는 플라스미드 DNA의 높은 수율을 얻기 위해 McNary-Nagel 미디 준비 키트를 사용합니다. 플라스미드가 예상 인서트를 포함하고 있음을 확인하려면, 제한 다이제스트를 수행하고 아가로즈 겔의 제품을 분석한다. 절단되지 않은 플라스미드는 또한 게놈 DNA 오염을 검사하기 위하여 아가로즈 젤에 분석될 수 있습니다. 템플릿 DNA를 선형화하기 위해, 플라스미드 DNA 20 μg, 적절한 제한 효소 2 μL, 1x 적절한 완충액을 포함하는 100 μL 제한 다이제스트 반응을 설정하였다. 37°C에서 2시간 이상 배양한다. 페놀/클로로포름 추출을 수행한 다음 클로로포름 추출을 수행하여 선형화된 DNA를 추출합니다. 100 % 에탄올로 DNA를 침전시. 이것은 시료에 2 부적의 차가운 에탄올을 첨가하고 고화될 때까지 -80 °C에서 배양하여 신속하게 수행 할 수 있습니다 (15-30 분). 12,000 x g/4°C에서 20분 동안 회전하여 펠릿 DNA에 냉장 원심분리기를 사용하십시오. 상급제를 제거하고 70 % 에탄올의 200 μL로 펠릿을 씻으십시오. 12,000 x g/4°C에서 5분 간 회전합니다. 상층 및 공기 건조 펠릿을 약 5 분 동안 제거하십시오. 1x TE의 20 μL에서 다시 일시 중단하고 추가 사용이 될 때까지 4 °C에서 보관하십시오. 안티센스 RNA 프로브를 합성하고 정화하기 위해 10 mM rCTP의 15 μL, 10 mM rGTP의 15 μL, 10 mM rATP의 15 μL, 10 mM rUTP의 9.75 μL, 및 10 mM의 5.25μL의 10mm rNTP를 결합하여 2.5 mM rNTP 믹스를 생성한다(10 mM rUTP의 9.75 μL, 및 10 mM 의 5.25μL 의 10mM rNTP). 단계 4.2-4.10으로부터 4 μg의 선형화된 템플릿 DNA를 포함하는 시험관내 전사 반응 50 μL을 설정하고, 15 μL의 2.5 mM rNTP 혼합물 단계 4.11, 5x 전사 완충제의 10 μL, 0.1 M DTT의 5 μL, RNAse 억제제의 0.5 μL (20 U/μL), 및 1.5 μL의 적절한 RNA 폴리머라제 (T3, T7, 또는 SP6). 37 °C에서 1 시간 배양. 반응에 1.5 μL의 RNA 폴리머라아제를 추가하고 추가 시간 동안 37°C로 되돌아갑니다. RQ1 DNAse 1 μL을 반응에 넣고 DNA 템플릿을 저하시키기 위해 10 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 시료에 7.5M LiCl 용액 30 μL을 추가합니다. 피펫을 -20°C에서 적어도 1시간 동안 혼합하고 배양한다. 냉장 원심분리기를 사용하여 샘플을 14,000 x g/4°C에서 25분 간 회전시다. 상급체를 제거하고 70 % 에탄올500 μL로 펠릿을 헹구십시오. 14,000 x g/4°C에서 5분 간 회전합니다. 약 5분 동안 상류 및 공기 건조 펠릿을 제거합니다. 하이브리드화 버퍼에서 샘플을 10 ng/μL의 농도로 희석하여 10x 프로브 스톡으로 생성(50% 포름아미드, 5x SSC (식염수 – 구연산나트륨, 750 mM NaCl, 75mMM 구연산염, pH 7.0), 1 mg / mL 토룰라 RNA, 0.1 % 트웬-20, 1 x 덴하르트 용액, 0.1 % CHAPS, 10 mM EDTA 및 100 μg / mL. 추가 사용이 될 때까지 -20°C에서 보관하십시오. 5. 유전자 발현 분석 : 시투 혼성화에서형광 참고: 모든 세안은 개별적으로 포장된 멸균 된 전사 파이펫을 사용하여 약 1 mL의 용액으로 수행해야합니다. 파이펫은 용액을 제거하거나 첨가할 때 플레이트 가장자리에 배치되어야 하며, 세안은 가능한 한 부드럽게 수행하여 세포가 플레이트 표면에서 빠지지 않고 손실되지 않도록 해야 합니다. 플레이트에서 1x PBS를 제거합니다(3.10단계에서). 신선한 1x PBS로 교체하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 0.1 M 트리에탄올라민(pH 8.0)의 25 mL와 아세트산 비하이드라이드 62.5 μL을 결합합니다. 잘 섞으세요. 이 용액으로 접시를 10 분 동안 씻으소서. 접시를 1x SSC로 5분 동안 씻으소서. 0.02 M HCl로 플레이트를 10 분 동안 씻어 세포를 투과시하십시오. 각각 5분 동안 1x PBS로 2x를 씻으소서. 용액을 제거하고 1 mL의 혼성화 버퍼를 추가하십시오 (50 % 포름 아미드, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 구연산나트륨, pH 7.0), 1 mg / mL 토룰라 RNA, 0.1 % 트웬-20, 1 x 덴하르트 용액, 0.1 % CHAPS, 10 mM EDTA 및 100 μg / mL 헤파린 플레이트. 60 °C에서 적어도 6 시간 동안 흔들어 서 배양하십시오. 혼성화 버퍼를 제거하고 1x RNA 프로브 용액의 750 μL로 교체하십시오 (4.19 단계에서 만든 10 x 스톡을 희석 한 형태) 센스 RNA 프로브는 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. 60 °C에서 8-14 시간 동안 흔들어 서 배양하십시오. 프로브를 제거하고 -20°C에서 보관하십시오.참고: 1x 프로브 희석은 폐기되기 전에 최대 3회재사용가능합니다. 0.2x SSC로 플레이트를 헹구고 있습니다. 60 °C에서 1 시간 동안 신선한 0.2x SSC로 씻으소서. 플레이트를 실온으로 옮기고 5분 동안 평형화합니다. 접시를 0.2x SSC로 5 분 동안 씻으소서. 15 분 동안 1x PBT로 접시를 씻으소서. 1x PBT(0.1% 트리톤-x-100)에서 2% H2O2로 플레이트를 1시간 동안 세척합니다.참고: 이 솔루션은 빛에 민감하므로 각 실험마다 신선하게 만들고 빛으로부터 보호해야 합니다. 플레이트는 또한 이 배양 중에 빛으로부터 보호되거나 포일되어야 합니다. 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 % 트위넨-20)로 15 분 동안 접시를 씻으소서. 말레산 완충제에서 2%로 차단 시약을 희석 (100 mM 말산, 150 mM NaCl, pH 7.5). 실온에서 적어도 1 시간 동안이 혼합물의 세포를 차단하십시오. 말레산 완충제의 2% 차단 시약에서 1:1,000을 희석한 안티 디그산소-POD 항체로 차단 용액을 교체하십시오. 4 °C에서 밤새 배양. 플레이트를 1x TBST로 3x 헹구어 보시고 자합니다. 연속 흔들림으로 세척당 최소 15분 동안 1x TBST의 2mL로 4x를 세척하십시오. 연속 흔들림으로 세척당 적어도 10분 동안 1x PBT로 2x를 씻으소서. 1x PBT에서 Cy3-컨쥬게이드 티라미드 1:25희석. 이 희석물의 750 μL로 접시를 5 분 동안 씻으소서.참고: 이 솔루션은 매우 가벼운 민감성이며, 신호 열화를 방지하기 위해 나머지 실험 기간 동안 플레이트를 빛으로부터 보호하거나 포일 처리해야 합니다. 이 용액에 0.3% H2O2의 2.5 μL을 추가하고 실온에서 추가로 40 분 동안 연속 흔들기로 배양하십시오. 연속 흔들림으로 세척당 최소 15분 동안 1x TBST로 4x를 세척하십시오. 1x PBT로 헹구고 자합니다. 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA, 및 3.7 % 포름알데히드에서 1 mM MgSO4)에서 실온에서 1 시간 동안 배양하여 세포를 고정시. 용액을 제거하고 1x PBS로 교체합니다. 플레이트를 포일 용기에 넣고 추가 처리될 때까지 4°C에 보관하십시오. 6. 이미징 셀 참고: 이미징은 거꾸로 된 공초점 현미경을 사용하여 수행되었다. 샘플 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 3.1 단계에서 만든 마크를 스테이지 의 전면에 정렬합니다. 그리드 라이닝 커버슬립이 보이도록 이미지에 초점을 맞추고, 3.4단계에서 촬영한 그리드 이미지를 참조로 사용하여, 칼슘 이미지에서 캡처한 시야에 맞게 시야를 조정합니다(섹션 3). 그리드와 셀의 밝은 필드 이미지를 수집합니다. 595 nm TRITC 레이저로 샘플을 조명합니다. 게인 값을 조정하여 음수 제어 셀의 이미지를 사용하여 신호를 배경과 적절히 구분하고 스틸 이미지를 수집합니다.참고: 이상적으로, 배경 형광 수준은 비 표적감각 RNA 프로브와 병렬로 처리된 음성 대조판에 기초하여 결정된다. 게인 설정은 이 플레이트가 완전히 검은색으로 나타나도록 조정된 다음(배경 수준에 해당) 실험 배치에서 이미지된 다른 플레이트에 대해 일정하게 유지됩니다. 7. 데이터 처리 참고: 데이터 처리는 Nikon Elements 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 3.7단계에서 2시간 칼슘 이미지를 엽니다. 이진 > 스팟 감지 및 밝은 반점을선택하여 각 개별 셀에 해당하는 픽셀을 식별합니다. FITC 채널이 선택되어 있는지 확인합니다. 이 레이어가 생성된 후 개별 셀 위에 컬러 원이 나타납니다. 가능한 한 많은 셀이 식별자와 인식되고 연관되도록 셀 분포 및 크기 매개 변수를 조정합니다. 보기 및 분석 컨트롤 > 추적 옵션으로이동하여 이미지의 모든 프레임에서 셀을 추적합니다. 5프레임을 트랙 사이의 최대 간격으로 설정하고, 600프레임 미만으로 연결된 객체를 삭제하고, 간격 닫기 옵션을 선택합니다. 바이너리 추적을 선택하여 이미지에 셀 추적을 적용합니다. 셀을 추적한 후 개별 셀(예: 셀 덩어리)에 해당하지 않는 개체를 수동으로 삭제합니다. 그러나, 데이터 포인트는 칼슘 활동 추적의 형태에 근거한 추가 분석에서 제외되어서는 안됩니다. 이미지 창에서 뷰 오버레이 및 이진 오브젝트 ID 표시를선택합니다. 이미지의 끝으로 스크롤 (프레임 901) 및 선택 편집 > 보기 스냅 샷 만들기 (8비트 RGB)> 현재 프레임 > 확인. 이렇게 하면 각 셀의 연결된 이진 ID가 표시되는 이미지의 마지막 프레임의 스냅샷이 생성됩니다. 이 이미지를 저장합니다. 모든 개체다음에 데이터를 Excel로 내보내기를 선택하여시간계 데이터를 내보냅니다. 출력을 CSV 파일로 저장합니다. FISH 이미지를 엽니다. FITC 채널 대신 TRITC 채널을 사용하여 7.1-7.2 단계와 같이 스팟 감지를 최적화합니다. 잘못 할당된 바이너리를 수동으로 삭제한 다음 자동 측정 결과 > 업데이트 측정을 선택하여 각 셀의 신호 강도를 계산합니다. 7.5 및 7.6 단계를 반복하여 이미지 스냅샷 및 데이터 테이블을 내보냅니다. 열 A가 FISH 이진 ID로 레이블이 지정되고 열 B에 칼슘 이진 ID로레이블이 지정되는 스프레드시트를 만듭니다. 7.5 단계 및 7.7단계로 내보낸 이미지를 엽니다. FISH 이미지(7.7단계)에서 식별된 각 개체에 대해 열 A에 이진 ID를 기록합니다. 그런 다음 칼슘 이미지(단계 7.5)에서 해당 셀을 찾아 두 이미지에서 자신 있게 식별할 수 없는 열 B. 셀에 이진 ID를 기록하면 스프레드시트에 추가해서는 안 됩니다.참고: Adobe Photoshop 또는 김프 이미지 편집기와 같은 사진 편집 프로그램을 사용하여 두 이미지를 모두 열고, 반투명하게 만들고, 파트너 이미지에 오버레이하여 각 셀과 연결된 두 개의 바이너리 ID를 보다 쉽게 식별하고 연결할 수 있습니다. 확인된 각 세포에 대해, 그 타임시리즈 칼슘 데이터(칼슘 이진 ID와 연관되고 7.6단계로 내보내진) 및 유전자 발현 데이터(FISH Binary ID와 연관되고 7.7단계로 내보낸)를 대조한다.참고: 다운스트림 데이터 처리 및 분석은 이러한 데이터를 단일 데이터 테이블에 정렬하고 스파이크 카운트, 프랙탈 분석 및 마르코비안 엔트로피를 포함한 분석 기법의 배열을 적용하여 조사자가 칼슘 활성의 새로운 패턴을 식별할 수 있도록 하는 17,18.