Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Tutto il lavoro che coinvolgeva animali è stato svolto secondo i protocolli approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il College of William and Mary. 1. Cura degli animali e manipolazione dell’embrione Indurre l’accoppiamento naturale somministrando un’iniezione sottocutanea di gonadotropina cirionica umana (HCG) nel sacco della linfa dorsale di Xenopus lavis adulto a una dose di 600 U per le femmine e 400 U per i maschi. Dopo l’iniezione, mettere almeno un maschio e una rana femmina in un serbatoio di tenuta a temperatura ambiente durante la notte. La deposizione delle uova inizia in genere 9-12 h dopo la somministrazione di HCG. Raccogliere gli embrioni. Dejelly lavando delicatamente con 2% cisteina (pH 8.0) per 2-4 min. Risciacquare gli embrioni 3x nella soluzione di 0,1x Margono modificato di Mark (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH regolato a 7.4–7.6). Trasferire gli embrioni a piatti Petri in vetro da 100 mm contenenti 0,1x MMR e 50 g/mL di genticina. È appropriata una densità di 50-100 embrioni per piastra. Incubare i piatti a 14 –22 gradi centigradi e lasciare che gli embrioni si sviluppino fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Rimuovere periodicamente le cellule non fecondate e gli embrioni necrotici o in via di sviluppo anomalo con una pipetta di trasferimento di plastica.NOTA: Per garantire la coerenza, la messa in scena dello sviluppo viene eseguita secondo i criteri morfologici definiti da Nieuwkoop e Faber16. Le fasi di interesse varieranno in base all’attenzione sperimentale. Ad esempio, i punti di riferimento chiave del neurosviluppo sono associati allo stadio 14 (insorgenza della neuriulazione), allo stadio 18 (insorgenza della chiusura del tubo neurale) e allo stadio 22 (insorgenza dell’allungamento del tailbud). 2. Dissezione dell’embrione e preparazione del campione Preparazione della soluzione Preparare la soluzione 2 mM Ca2 con 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl22H2H 2,1.31 mM MgSO4e 4.6 mM Tris. Per ogni soluzione da 100 mL, aggiungere 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 U/mL penicillina; 10.000 streptomici). Regolare pH a 7.8 e filtrare-sterilizzare. Prepara la soluzione senza calcio e magnesio (CMF) combinando 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris e EDTA di 0,4 mM. Regolare pH a 7.8 e autoclave per sterilizzare. Per ogni soluzione da 100 mL, aggiungere 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 U/mL penicillina; 10.000 streptomici). Regolare pH a 7.8 e filtrare-sterilizzare. Preparazione di piastre per dissezione e imaging UV-sterilizzare due piatti Petri in plastica da 35 mm e un piatto di coltura cellulare da 35 mm (vedere Tabella dei materiali). Mentre si lavora in un cofano a flusso laminare, preparare due tubi conici in plastica da 50 mL contenenti 10 mL di soluzione Ca2 x da 2 mM ciascuno. Continuate a lavorare nella cappa a flusso laminare e aggiungete 2 mL di 2 mM Ca2 a una piastra Petri in plastica da 35 mm, 2 mL di 2 mM Ca2 a una cell Culture Dish da 35 mm e 2 mL di soluzione CMF a una parabola Petri in plastica da 35 mm. Al di fuori del cofano a flusso laminare, riempire due piatti Petri in plastica da 100 mm e un piatto Petri in plastica da 35 mm con 0,1x MMR con gentamycina (50 g/mL). Riempire un piatto Petri in plastica da 60 mm con il 70% di etanolo. Immediatamente prima della dissezione, aggiungere 0,01 g di Collagenase B a uno dei tubi da 50 mL contenenti la soluzione Ca2. Mescolare bene e trasferire la soluzione in un piatto Petri di plastica fresca da 60 mm. Con l’aiuto di un microscopio sezionato, identificare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire almeno sei embrioni appropriati in una delle piastre da 100 mm contenenti 0,1 x MMR – gentnemica preparata al punto 2.2.4. Questo servirà come piastra di contenimento. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire un embrione alla seconda piastra da 100 mm contenente 0,1x MMR e gentamicina. Questo servirà come piastra di dissezione. Se si sezionano embrioni abbastanza vecchi da muoversi (circa lo stadio 23 o più vecchio), anantichezzano ogni embrione prima della dissezione trasferendolo in un piatto contenente lo 0,1% 3-aminobenzoico ester etilico diluito in 0,1x MMR con gentamicina (50 g/mL). Una volta immobilizzato l’embrione, trasferirlo nuovamente nel piatto contenente 0,1 x MMR con gentamicina (50 g/mL) e continuare con la dissezione. Rimuovere con attenzione la membrana vitelline che circonda l’embrione. Questo può essere fatto più facilmente utilizzando un paio di pinze smussate per stabilizzare l’embrione durante l’utilizzo di un paio di pinze sottili per afferrare la membrana. Tirare con cura con le pinze sottili per sbucciare la membrana villine a parte. Utilizzare pinze sottili per separare le regioni dorsali e ventrali dell’embrione. Questo può essere fatto utilizzando le pinze per ‘pizzicare’ l’embrione lungo l’asse anteriore-posteriore, tagliandolo a metà. Con una pipetta di trasferimento sterile, trasferire la porzione dorsale alla piastra da 60 mm con soluzione di collagenae preparata al passaggio 2.2.5. Eliminare la parte ventrale. Lasciare che l’espianto dorsale incuba nella soluzione di collagenae per 1–2 min a temperatura ambiente. Trasferirlo delicatamente sulla piastra di dissezione. Completare la dissezione rimuovendo con attenzione tutte le contaminazioni endodermiche e mesodermiche residue dal tessuto neurale presuntivo dell’ectoderma. Per gli embrioni allo stadio 22 o più anziani, anche il tubo neurale deve essere rimosso e scartato.NOTA: Se necessario durante la dissezione, il piatto del 70% di etanolo preparato al punto 2.2.4 può essere utilizzato per cancellare o ri-sterilizzare le pinze. Una volta completata la dissezione, trasferire delicatamente l’espiantato alla piastra da 35 mm della soluzione Ca2 o preparato nel passaggio 2.2.3. Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,9 fino a quando non sono stati raccolti quattro espianti. Utilizzare una micropipetta P1000 per trasferire tutti e quattro gli espianti alla piastra da 35 mm contenente la soluzione CMF, avendo cura di evitare qualsiasi contatto tra gli espianti e l’interfaccia aria-acqua. Ruotare delicatamente il piatto in modo che tutti gli espianti si amgruppino al centro del piatto. Incubare 1 h a temperatura ambiente per consentire agli espianti di dissociare.NOTA: per facilitare la dissociazione, è possibile aggiungere alla soluzione CMF 0,025%–0,01% trypsin. Ciò può essere necessario per una dissociazione efficiente degli embrioni più vecchi (stadio 22 e più anziani). A questo punto, almeno due embrioni opportunamente messi in scena devono rimanere sulla piastra di contenimento. Trasferire questi embrioni in un piatto fresco riempito con 0,1x MMR con gentamicina preparata al punto 2.2.4 e consentire loro di svilupparsi indisturbati con il piatto coperto per abbinare il piatto espiante. Questi embrioni serviranno come controlli di fratello. Utilizzare la supercolla per attaccare un coperchio micro-regolato (vedi Tabella dei materiali) alla parte inferiore del piatto di coltura cellulare da 35 mm preparato nel passaggio 2.2.3.NOTA: Posizionare piccoli tocchi di supercolla intorno ai bordi della vetritta, quindi premere saldamente contro la parte inferiore del Cell Culture Dish. Le marcature di posizione saranno oscurate ovunque la colla contatti la griglia, quindi è importante mantenere la parte centrale a griglia del coperchio libera dall’adesivo. Dopo che gli espianti si sono dissociati per 1 h, utilizzare una micropipetta P100 per trasferirli al Cell Culture Dish. Al fine di placcare il maggior numero possibile di celle sulla porzione grigliata del piatto, tenere la pipetta ad un angolo poco profondo vicino alla superficie del piatto, posizionare la punta della pipetta nell’angolo della griglia rivolto verso l’interno ed espellere saldamente la sospensione cellulare attraverso l’ar grigliato Idealmente, le cellule si depositano in un ammasso denso stretto. Incubare per 1 h a temperatura ambiente per consentire alle cellule di aderire alla piastra. Determinare e registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratello quando inizia questa incubazione. Unire 5 1 mM Fluo-4 AM (vedi Tabella dei materiali)con 2 – L di 10% di acido Pluronico F-127.NOTA: Fluo-4 AM è sensibile alla luce e deve essere sempre conservato in un tubo sicuro per la luce o coperto di lamina. Una volta completata l’incubazione, spostare il piatto campione in una camera oscura o in un altro luogo protetto dalla luce. Utilizzare una micropipetta per rimuovere 100 l di soluzione dal bordo del piatto. Aggiungere questa soluzione all’aliquota dell’acido F-127 Fluo-4 AM/Pluronic, pipetta su e giù per mescolare, e restituire l’intero volume al piatto campione. Swirl delicatamente per mescolare. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e lasciare incubare per 1 h a temperatura ambiente. Determinare e registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratello quando inizia questa incubazione. Alla fine dell’incubazione, utilizzare il restante tubo conico di 2 mM Ca2 per eseguire tre fughe multimediali nel modo seguente: 1) rimuovere 1 mL di soluzione dal piatto, aggiungere 3 mL di soluzione fresca, 2) rimuovere 3 mL di soluzione dal piatto, aggiungere 3 mL di soluzione fresca, 3) rimuovere 3 mL di soluzione dal piatto, aggiungere 3 mL di soluzione fresca. 3. Imaging di calcio NOTA: l’imaging del calcio è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale invertito (Tabella dei materiali). Posizionare la piastra di campionamento sullo stadio del microscopio, avendo cura di proteggerla dall’esposizione alla luce ambiente. Una volta fissata la piastra, utilizzare un marcatore per etichettare il punto anteriore della piastra in modo che lo stesso campo visivo possa essere trovato nelle immagini successive. Individuare il campione al microscopio , prima a 10X e poi all’ingrandimento 20X, e selezionare un campo visivo appropriato per l’imaging. Un campo visivo ideale è ad alta densità di cellule, ma non così denso che le cellule sono raggruppate o difficili da distinguere singolarmente. Regolare la messa a fuoco del microscopio in modo che il coperchio a griglia sia visibile. I numeri contrassegnati sulla coverslip fungono da identificatori univoci per un particolare locus della griglia e possono essere utilizzati per individuare lo stesso campo visivo per ulteriori immagini. Se il campo visivo selezionato in origine non si sovrappone ad alcun numero, regolare nuovamente fino a quando non viene in quadrata un numero identificabile. Porta a fuoco un’immagine a campo luminoso del campo visivo selezionato con la copertina a griglia a fuoco. Regolare le impostazioni di messa a fuoco e scattare un’immagine di campo luminoso del campo visivo selezionato con le celle a fuoco. Con lo strato di cella a fuoco, illuminare i campioni con un laser da 488 nm. I valori HV e Offset possono essere ottimizzati per ogni esperimento per garantire che un intervallo dinamico di fluorescenza venga rilevato sul canale FITC. Per un’immagine di due ore, modificare la configurazione di imaging per registrare 901 fotogrammi con un tempo di scansione di 3,93 s e un intervallo di 8 s. Eseguire la configurazione per acquisire l’immagine. Una volta completata l’imaging, rimuovere la piastra dallo stadio del microscopio. Rimuovere 1 mL di soluzione dalla piastra e sostituirlo con 1 mL di 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA, e 2 mM MgSO4 in 7.4% formaldeide). Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente o peruna notte a 4 gradi centigradi. Determinare e registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratello quando inizia questa incubazione. Al termine della fissazione, rimuovere tutta la soluzione dalla piastra e sostituirla con 2 mL di 1x PBS. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi per un’ulteriore lavorazione. 4. Analisi dell’espressione genica: sintesi della sonda Come descritto di seguito, generare una sonda RNA antisenso per l’ibridazione in situ. Inoltre, generare una sonda di rilevamento per lo stesso gene da utilizzare come controllo negativo. Al fine di purificare il DNA plasmide contenente la sequenza del modello di sonda, inoculate 150 mL di brodo LB con scorte di glicerolo batterico contenenti il plasmide modello. Incubare a 37 gradi centigradi con agitazione durante la notte o fino a quando la cultura è torbida. Purificare il DNA plasmide dalla coltura batterica utilizzando il vostro metodo di scelta.NOTA: Usiamo il kit McNary-Nagel midi-prep per ottenere alte rese di DNA plasmide. Per confermare che il plasmide contiene l’inserto previsto, eseguire un digest di restrizione e analizzare i prodotti su un gel di agarose. Il plasmide non tagliato può anche essere analizzato su un gel di agarose per verificare la contaminazione genomica del DNA. Per linearizzare il DNA del modello, impostare una reazione di digerimento di restrizione di 100 -l contenente 20 g di DNA plasmide, 2 l dell’enzima di restrizione appropriato e 1 tampone appropriato. Incubare a 37 gradi centigradi per almeno 2 h. Estrarre il DNA linearizzato eseguendo un’estrazione fenolo/cloroformato seguita da un’estrazione cloroformato. DNA precipitato con etanolo al 100%. Questo può essere fatto rapidamente aggiungendo due volumi di etanolo freddo al campione e incubandolo a -80 gradi centigradi fino a quando non si solidifica (15-30 min). Utilizzare una centrifuga refrigerata per pelletre il DNA filando per 20 min a 12.000 x g/4 gradi centigradi. Togliere il supernatante e lavare il pellet con 200 o L del 70% di etanolo. Girare per 5 min a 12.000 x g/4 gradi centigradi. Togliere il supernatante e il pellet asciutto all’aria per circa 5 min. Resuspend in 20 . Per sintetizzare e purificare la sonda antisenso RNA, creare un mix di 2,5 m rNTP combinando 15 unità di 10 mM rCTP, 15 l di 10 mM rGTP, 15 l di 10 mM rATP, 9,75 unità da 10 mM rUTP e 5,25 L di 10 mM dig-11 UTP (Vedi tabella dei materiali). Impostare una reazione di trascrizione di 50 L in vitro contenente 4 g di DNA modello linearizzato dal punto 4.2-4.10, 15 ll di 2,5 mM di miscela rNTP dal passo 4,11, 10 L di 5x buffer di trascrizione, 5 -L di 0,1 M DTT, 0,5 L di inibitore di RNAse (20 U /L) e 1,5 l di polimerasi RNA appropriata (T3, T7 o SP6). Incubare 1 h a 37 . Aggiungere alla reazione altri 1,5 di RNA polimerasi e tornare a 37 gradi centigradi per un’ora aggiuntiva. Aggiungete 1 L di RQ1 DNAse per reagire e incubate a 37 gradi centigradi per 10 min per degradare il modello di DNA. Aggiungere da un po’ di tempo una soluzione liCl da 7,5 M da campionare. Pipetta per mescolare e incubare a -20 gradi centigradi per almeno 1 h. Utilizzando una centrifuga refrigerata, far girare il campione 25 min a 14.000 x g/4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante e sciacquare il pellet con 500 luna del 70% di etanolo. Girare per 5 min a 14.000 x g/4 gradi centigradi. Rimuovere il prevero supernatante e l’aria secca per circa 5 min. Resuspend in 20 gradi di acqua priva di nuclenon. Creare a 10x scorta di sonda diluindo il campione a una concentrazione di 10 ng/ 5x SSC (citrato saline-sodio; 750 mM NaCl, 75 mM citrato di sodio, pH 7.0), 1 mg/mL di RNA torula, 0,1 % Tween-20, 1x Soluzione di Denhardt, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA e 100g/mL heparin). Conservare a -20 gradi centigradi fino a nuovo utilizzo. 5. Analisi dell’espressione genica: fluorescenza nell’ibridazione situ NOTA: Tutti gli involucri devono essere eseguiti con circa 1 mL di soluzione utilizzando una pipetta di trasferimento sterile e avvolta individualmente. La pipetta deve essere posizionata sul bordo della piastra durante la rimozione o l’aggiunta della soluzione, e i lavamenti devono essere eseguiti nel modo più dolce possibile per garantire che le cellule non siano scostate dalla superficie della piastra e perse. Rimuovere 1x PBS dalla piastra (dal passaggio 3.10). Sostituire con 1x PBS fresco e incubare 5 min a temperatura ambiente. Unire 25 mL di trietanolamina da 0,1 M (pH 8,0) con 62,5 . Mescolare bene. Lavare la piastra con questa soluzione per 10 min. Lavare la piastra con 1x SSC per 5 min. Lavare la piastra con 0,02 M HCl per 10 min per permeabilizzare le cellule. Lavare 2x con 1x PBS per 5 min ciascuno. Rimuovere la soluzione e aggiungere 1 mL di Hybridization Buffer (50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM di citrato di sodio, pH 7.0), 1 mg/mL di RNA torula, 0,1% Tween-20, 1x Soluzione di Denhardt, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA e 100 g/mL di eparina) a piastra. Incubare agitando per almeno 6 h a 60 gradi centigradi. Rimuovere il buffer di ibridazione e sostituire con 750 l una soluzione di 1x RNA Probe (forma diluita il brodo 10x realizzato al passaggio 4.19. Le sonde Sense RNA possono essere utilizzate come controllo negativo. Incubare agitando per 8-14 h a 60 gradi centigradi. Rimuovere la sonda e conservarla a -20 gradi centigradi.NOTA: 1x la diluizione della sonda può essere riutilizzata fino a tre volte prima di essere scartata. Sciacquare la piastra con 0,2x SSC. Lavare con s.p.a. fresco per 1 h a 60 gradi centigradi. Spostare le piastre a temperatura ambiente ed eseguire l’acquisillo per 5 min. Lavare la piastra con 0,2x SSC per 5 min. Lavare la piastra con 1x PBT per 15 min. Lavare la piastra con 2% H2O2 in 1x PBT (0.1% Triton-x-100) per 1 h.NOTA: Questa soluzione è sensibile alla luce, quindi dovrebbe essere resa fresca per ogni esperimento e schermata dalla luce. Le piastre devono anche essere schermate dalla luce o sventate durante questa incubazione. Lavare la piastra con 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) per 15 min. Diluire il Reagente di blocco al 2% nel buffer dell’acido maleico (100 mm di acido maschile, 150 mM NaCl, pH 7.5). Bloccare le cellule in questa miscela per almeno 1 h a temperatura ambiente. Sostituire la soluzione di blocco con anticorpo anti-digoxygenin-POD diluito 1:1,000 in 2% Blocking Reagent in Maleic Acid Buffer. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi. Sciacquare la piastra 3x con 1x TBST. Lavare 4x con 2 mL di 1 TBST per almeno 15 min per lavaggio con dondolo continuo. Lavare 2x con 1x PBT per almeno 10 min per lavaggio con dondolo continuo. Diluire la tyramide coniugata Cy3 1:25 in 1x PBT. Lavare la piastra con 750 l di questa diluizione per 5 min.NOTA: Questa soluzione è estremamente sensibile alla luce e le piastre devono essere tenute screpolate o schermate dalla luce per il resto dell’esperimento per evitare il deterioramento del segnale. Aggiungere a questa soluzione 2,5 lrate di 0,3% H2O2 e incubare con dondolo continuo per ulteriori 40 min a temperatura ambiente. Lavare 4x con 1x TBST per almeno 15 min per lavaggio con dondolo continuo. Risciacquare con 1x PBT. Fissare le cellule incubando per 1 h a temperatura ambiente in 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA, e 1 mM MgSO4 in 3.7% formaldeide). Rimuovere la soluzione e sostituirla con 1x PBS. Conservare le piastre in un contenitore sventato a 4 gradi centigradi fino a un’ulteriore lavorazione. 6. Celle di imaging NOTA: l’imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale invertito. Posizionare la piastra campione sullo stadio del microscopio, allineando il marchio realizzato al punto 3.1 alla parte anteriore dello stage. Mettere a fuoco l’immagine in modo che sia visibile lo sguardo della griglia scattata nel passaggio 3.4 come riferimento, regolare il campo visivo in modo che corrisponda al campo visivo acquisito nell’immagine di calcio (Sezione 3). Acquisire immagini a campo luminoso sia della griglia che delle celle. Illuminare i campioni con un laser TRITC da 595 nm. Regolare i valori di guadagno per distinguere in modo appropriato il segnale dallo sfondo utilizzando le immagini dalle celle di controllo negative e acquisire un’immagine fissa.NOTA: Idealmente, i livelli di fluorescenza di fondo sono determinati in base a una piastra di controllo negativa elaborata in parallelo con una sonda di RNA a senso non targeting. Le impostazioni di guadagno vengono regolate in modo che questa piastra sembri completamente nera (corrispondente ai livelli di sfondo), quindi mantenuta costante per le altre piastre immagini da quel lotto sperimentale. 7. Trattamento dei dati NOTA: l’elaborazione dei dati è stata eseguita utilizzando il software Nikon Elements. Aprire l’immagine di 2 h di calcio dal punto 3.7. Identificare i pixel corrispondenti a ogni singola cella selezionando Binario > Rilevamento macchie > Macchie luminose. Assicurarsi che il canale FITC sia selezionato. I cerchi colorati appariranno sulle singole celle dopo la generazione di questo livello. Regolare i parametri di dimensione e distribuzione delle celle in modo che il maggior numero possibile di celle venga riconosciuto e associato a un identificatore univoco. Tenere traccia delle celle in tutti i fotogrammi dell’immagine passando a Visualizza > Controlli analisi > Opzioni di rilevamento. Impostate 5 fotogrammi come spazio massimo tra le tracce, eliminate gli oggetti associati a meno di 600 fotogrammi e selezionate l’opzione Chiudi spazi. Selezionare Traccia binari per applicare il tracciamento delle celle all’immagine. Dopo che le celle sono state tracciate, eliminare manualmente qualsiasi oggetto che non corrisponde a una singola cella (ad esempio un gruppo di celle). Tuttavia, i punti dati non dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi basate sulla morfologia della traccia di attività del calcio. Nel riquadro Immagine, selezionare Visualizza sovrapposizione > Mostra ID oggetto binario. Scorrere fino alla fine dell’immagine (fotogramma 901) e selezionare Modifica > Crea istantanea vista (8bit RGB)> Fotogramma corrente > OK. Verrà creata un’istantanea dell’ultimo fotogramma dell’immagine con l’ID binario associato di ogni cella visibile. Salvare questa immagine. Esportare i dati di serie temporali selezionando tutti gli oggetti seguiti da Esporta datiin Excel . Salvare l’output come file CSV. Aprire l’immagine FISH. Ottimizzare il rilevamento spot come nei passaggi 7.1–7.2, utilizzando il canale TRITC anziché il canale FITC. Eliminare manualmente i file binari assegnati in modo non corretto, quindi selezionare Risultati misurazione automatica > Aggiorna misurazione per calcolare l’intensità del segnale di ogni cella. Esportare uno snapshot dell’immagine e una tabella dati ripetendo i passaggi 7.5 e 7.6. Creare un foglio di calcolo in cui la colonna A è etichettata FISH Binary ID e la colonna B è etichettata ID binario di calcolo. Aprire le immagini esportate nei passaggi 7.5 e 7.7. Per ogni oggetto identificato nell’immagine FISH (passaggio 7.7), registrare l’ID binario nella colonna A. Quindi, individuare la cella corrispondente nell’immagine di calcio (passaggio 7.5) e registrare l’ID binario nella colonna B. Le celle che non possono essere identificate con sicurezza in entrambe le immagini non devono essere aggiunte al foglio di calcolo.NOTA: può essere utile utilizzare un programma di fotoritocco come Adobe Photoshop o l’editor di immagini GIMP per aprire entrambe le immagini, crearne una semitrasparente e sovrapporla all’immagine partner per identificare e collegare più facilmente i due ID binari associati a ogni cella. Per ogni cella identificata, fascicolare (manualmente o con uno script) i dati relativi al calcio della serie temporale (associati all’ID binario del calcio ed esportati nel passaggio 7.6) e i dati dell’espressione genica (associati all’ID binario FISH ed esportati nel passaggio 7.7).NOTA: l’elaborazione e l’analisi dei dati a valle possono comportare la raccolta di questi dati in un’unica tabella di dati e l’applicazione di una serie di tecniche analitiche, tra cui il conteggio dei picchi, l’analisi frattale e l’entropia markoviaria che consentono allo sperimentatore di discernere nuovi modelli di attività del calcio 17,18.