Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Alle Arbeiten mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am College of William and Mary genehmigt wurden. 1. Tierpflege und Embryo-Handhabung Induzieren Sie die natürliche Paarung durch Verabreichung einer subkutanen Injektion von humanem Choriongonadotropin (HCG) in den dorsalen Lymphsack des erwachsenen Xenopus laevis in einer Dosis von 600 U für Frauen und 400 U für Männer. Nach der Injektion mindestens einen männlichen und einen weiblichen Frosch über Nacht in einen Raumtemperatur-Haltetank geben. Die Eiablage beginnt in der Regel 9-12 h nach der HCG-Verabreichung. Sammeln Sie Embryonen. Entjelly durch sanftes Waschen mit 2% Cystein (pH 8,0) für 2-4 min. Spülen Sie die Embryonen 3x in 0.1x Mark es Modified Ringer es Solution (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH angepasst auf 7.4–7.6). Übertragen Sie die Embryonen auf 100 mm Glas Petrischalen mit 0,1x MMR und 50 g/ml Gentamycin. Eine Dichte von 50-100 Embryonen pro Platte ist angemessen. Die Schalen bei 14 °C–22°C bebrüten und die Embryonen entwickeln lassen, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreichen. Entfernen Sie regelmäßig unbefruchtete Zellen und nekrotische oder sich abnorm entwickelnde Embryonen mit einer Kunststoff-Transferpipette.ANMERKUNG: Um Konsistenz zu gewährleisten, wird die Entwicklungsinszenierung nach morphologischen Kriterien durchgeführt, die von Nieuwkoop und Faber16definiert wurden. Die Stadien des Interesses variieren je nach experimentellem Fokus. Beispielsweise sind wichtige neuroentwicklungstechnische Landmarken mit Stufe 14 (Beginn der Neurulation), Stufe 18 (Beginn des Neuralrohrverschlusses) und Stufe 22 (Beginn der Schwanzknospendehnung) verbunden. 2. Embryo-Dissektion und Probenvorbereitung Lösungsvorbereitung Bereiten Sie 2 mM Ca2+ Lösung mit 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2,2H2O, 1,31 mM MgSO4und 4,6 mM Tris vor. Geben Sie für jede 100 ml-Lösung 1 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin; 10.000 g/ml Streptomycin) hinzu. PH auf 7,8 einstellen und filtersterilisieren. Bereiten Sie kalzium- und magnesiumfreie (CMF) Lösung durch Kombination von 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris und 0,4 mM EDTA. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,8 und den Autoklaven ein, um zu sterilisieren. Geben Sie für jede 100 ml-Lösung 1 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin; 10.000 g/ml Streptomycin) hinzu. PH auf 7,8 einstellen und filtersterilisieren. Herstellung von Platten für Diesektion und Bildgebung UV-sterilisieren sie zwei 35 mm Kunststoff-Petrischalen und eine 35 mm Zellkulturschale (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie bei der Arbeit in einer laminaren Durchflusshaube zwei 50 ml Kunststoffkonusrohre vor, die jeweils 10 ml 2 mM Ca2+ Lösung enthalten. Bleiben Sie in der laminaren Durchflusshaube und fügen Sie 2 ml 2 mM Ca2+ Lösung zu einer 35 mm Kunststoff Petrischale, 2 ml 2 mM Ca2+ Lösung zu einer 35 mm Zellkulturschale und 2 ml CMF-Lösung zu einer 35 mm Kunststoff Petrischale hinzu. Außerhalb der laminaren Durchflusshaube zwei 100 mm Kunststoff Petrischalen und eine 35 mm Kunststoff Petrischale mit 0,1x MMR mit Gentamycin (50 g/ml) füllen. Füllen Sie eine 60 mm Kunststoff Petrischale mit 70% Ethanol. Unmittelbar vor der Zerlegung 0,01 g Collagenase B in eines der 50 ml-Rohre, die Ca2+ Lösung enthalten. Gut mischen und die Lösung auf eine frische 60 mm Kunststoff Petrischale übertragen. Identifizieren Sie mit Hilfe eines Sezierensmikroskops Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um mindestens sechs geeignete Embryonen auf eine der 100-mm-Platten zu übertragen, die 0,1x MMR + Gentamycin enthalten, die in Schritt 2.2.4 hergestellt werden. Dies dient als Halteplatte. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um einen Embryo auf die zweite 100-mm-Platte mit 0,1x MMR + Gentamycin zu übertragen. Dies dient als Sezierplatte. Wenn Embryonen seziert werden, die alt genug sind, um sich zu bewegen (ungefähr Stadium 23 oder älter), befeuchten Sie jeden Embryo vor der Zerlegung, indem Sie ihn in eine Schale übertragen, die 0,1% 3-Aminobenzoesäure-Ethylester enthält, die in 0,1x MMR mit Gentamycin (50 g/ml) verdünnt wird. Sobald der Embryo immobilisiert ist, übertragen Sie ihn zurück in die Schale, die 0,1x MMR mit Gentamycin (50 g/ml) enthält, und fahren Sie mit der Zerlegung fort. Entfernen Sie vorsichtig die Vitelline-Membran, die den Embryo umgibt. Dies kann am einfachsten durch die Verwendung eines Paares von stumpfen Zangen, um den Embryo zu stabilisieren, während mit einem Paar feine Zange, um die Membran zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig mit den feinen Zangen, um die Vitelline-Membran auseinander zu schälen. Verwenden Sie feine Zangen, um die dorsalen und ventralen Bereiche des Embryos zu trennen. Dies kann durch die Verwendung der Zange erfolgen, um den Embryo entlang der vorderen hinteren Achse zu “kneifen” und ihn zu halbieren. Mit einer sterilen Transferpipette den dorsalen Teil mit Kollagenaselösung in Schritt 2.2.5 auf die 60 mm Platte übertragen. Entsorgen Sie den ventralen Teil. Lassen Sie die dorsale Explantation in der Kollagenaselösung für 1–2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie es vorsichtig zurück auf die Sezierplatte. Vervollständigen Sie die Dissektion, indem Sie sorgfältig alle restlichen endodermalen und mesodermalen Verunreinigungen aus dem mutmaßlichen Neuronalgewebe des Ektoderms entfernen. Bei Embryonen ab Stufe 22 sollte das Neuralrohr ebenfalls entfernt und entsorgt werden.HINWEIS: Bei Bedarf kann die in Schritt 2.2.4 zubereitete Schale aus 70 % Ethanol verwendet werden, um die Zange zu löschen oder erneut zu sterilisieren. Nach Abschluss der Sezierung die Explantation vorsichtig auf die in Schritt 2.2.3 hergestellte 35-mm-Platte der Ca2+-Lösung übertragen. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.9, bis vier Ex-Pflanzen gesammelt wurden. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um alle vier Explants auf die 35-mm-Platte mit CMF-Lösung zu übertragen, wobei darauf geachtet wird, dass kein Kontakt zwischen den Explants und der Luft-Wasser-Schnittstelle besteht. Wirbeln Sie die Schale vorsichtig, so dass sich alle Explants in der Mitte der Platte häufen. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich Die Explantationen dissoziieren können.HINWEIS: Zur Unterstützung der Dissoziation können der CMF-Lösung 0,025% – 0,01% Trypsin hinzugefügt werden. Dies kann für eine effiziente Dissoziation älterer Embryonen erforderlich sein (Stufe 22 und älter). An dieser Stelle sollten mindestens zwei entsprechend inszenierte Embryonen auf der Halteplatte verbleiben. Übertragen Sie diese Embryonen auf eine frische Schale, die mit 0,1x MMR gefüllt ist, mit Gentamycin, das in Schritt 2.2.4 zubereitet wird, und lassen Sie sie sich ungestört mit der abgedeckten Schale entwickeln, die der Explantschale entspricht. Diese Embryonen dienen als Geschwisterkontrollen. Verwenden Sie Superkleber, um einen mikrogeregelten Deckelschlupf (siehe Materialtabelle)an der Unterseite der in Schritt 2.2.3 hergestellten 35 mm Zellkulturschale zu befestigen.HINWEIS: Legen Sie kleine Tupfer Superkleber um die Ränder des Deckels, dann drücken Sie es fest gegen die Unterseite der Cell Culture Dish. Die Positionsmarkierungen werden überall dort verdeckt, wo der Kleber mit dem Gitter in Berührung kommt, daher ist es wichtig, den zentralen Gitterteil des Deckelrutsches frei von Klebstoff zu halten. Nachdem sich die Expflanzen 1 h getrennt haben, verwenden Sie eine P100-Mikropipette, um sie zum Zellkulturgericht zu übertragen. Um so viele Zellen wie möglich auf den gerasterten Teil der Schale zu verkleben, halten Sie die Pipette in einem flachen Winkel nahe der Oberfläche der Schale, positionieren Sie die Pipettenspitze in der Ecke des Gitters nach innen gerichtet, und vertreiben Sie die Zellsuspension fest über die gerasterte ar ea. Idealerweise setzen sich Zellen in einem dichten dichten Cluster ab. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, damit die Zellen an der Platte haften können. Bestimmen und erfassen Sie die Entwicklungsphase der Geschwisterkontrollembryonen, wenn diese Inkubation beginnt. Kombinieren Sie 5 l 1 mM Fluo-4 AM (siehe Materialtabelle) mit 2 l mit 10% Pluronischer F-127-Säure.HINWEIS: Fluo-4 AM ist lichtempfindlich und sollte jederzeit in einem lichtsicheren oder folienbedeckten Rohr aufbewahrt werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, verschieben Sie die Probenschale in eine Dunkelkammer oder an einen anderen lichtgeschützten Ort. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 100 l Lösung vom Rand der Schale zu entfernen. Fügen Sie diese Lösung zum Aliquot von Fluo-4 AM/Pluronic F-127 Säure, Pipette nach oben und unten, um zu mischen, und geben Sie das volle Volumen auf die Probenschale zurück. Sanft wirbeln, um es zu mischen. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und lassen Sie für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Bestimmen und erfassen Sie die Entwicklungsphase der Geschwisterkontrollembryonen, wenn diese Inkubation beginnt. Am Ende der Inkubation verwenden Sie die verbleibende konische Röhre von 2 mM Ca2+, um drei Medienwäschen in folgender Weise durchzuführen: 1) entfernen Sie 1 ml Lösung aus der Schale, fügen Sie 3 ml frische Lösung, 2) entfernen 3 ml Lösung aus der Schale, fügen Sie 3 ml frische Lösung, 3) entfernen 3 ml Lösung aus der Schale, fügen Sie 3 ml frische Lösung. 3. Calcium Imaging HINWEIS: Die Calcium-Bildgebung wurde mit einem invertierten konfokalen Mikroskop (Materialtabelle )durchgeführt. Legen Sie die Probenplatte auf die Mikroskopstufe und achten Sie darauf, sie vor Umgebungslichteinwirkung zu schützen. Sobald die Platte gesichert ist, verwenden Sie einen Marker, um den vorderen Punkt der Platte zu beschriften, so dass das gleiche Sichtfeld in der nachfolgenden Abbildung gefunden werden kann. Suchen Sie die Probe unter dem Mikroskop – zuerst bei 10X und dann bei der 20-fachen Vergrößerung – und wählen Sie ein geeignetes Sichtfeld für die Bildgebung aus. Ein ideales Sichtfeld ist zelldicht, aber nicht so dicht, dass Zellen verklumpt oder schwer einzeln zu unterscheiden sind. Stellen Sie den Mikroskopfokus so ein, dass der gittergeregelte Abdeckungsslip sichtbar ist. Die auf dem Deckblatt markierten Zahlen dienen als eindeutige Kennungen für einen bestimmten Raster-Lokus und können verwendet werden, um dasselbe Sichtfeld für zusätzliche Bildgebung zu lokalisieren. Wenn sich das ursprünglich ausgewählte Sichtfeld nicht mit Zahlen überlappt, müssen Sie nachjustieren, bis eine identifizierbare Zahl im Rahmen ist. Nehmen Sie ein helles Feldbild des ausgewählten Sichtfeldes mit dem gitterregelbaren Deckslip im Fokus. Passen Sie die Fokuseinstellungen an, und nehmen Sie ein helles Feldbild des ausgewählten Sichtfelds mit den Zellen im Fokus. Mit der Zellschicht im Fokus, beleuchten Sie die Proben mit einem 488 nm Laser. HV- und Offset-Werte können für jedes Experiment optimiert werden, um sicherzustellen, dass ein dynamischer Fluoreszenzbereich auf dem FITC-Kanal erkannt wird. Ändern Sie für ein zweistündiges Bild die Bildkonfiguration, um 901 Frames mit einer Scanzeit von 3,93 s und einem Intervall von 8 s aufzuzeichnen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte von der Mikroskopstufe. Entfernen Sie 1 ml Lösung von der Platte und ersetzen Sie sie durch 1 ml 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA und 2 mM MgSO4 in 7,4% Formaldehyd). Inkubieren Sie die Platte für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Bestimmen und erfassen Sie die Entwicklungsphase der Geschwisterkontrollembryonen, wenn diese Inkubation beginnt. Nachdem die Fixierung abgeschlossen ist, entfernen Sie alle Lösung von der Platte und ersetzen Sie sie durch 2 ml 1x PBS. Platten bei 4 °C zur Weiterverarbeitung lagern. 4. Genexpressionsanalyse: Sondensynthese Wie unten beschrieben, erzeugen Sie eine Antisense-RNA-Sonde für die In-situ-Hybridisierung. Darüber hinaus generieren Sie eine Sinnsonde für das gleiche Gen für die Verwendung als Negative Kontrolle. Um Plasmid-DNA zu reinigen, die die Sondenschablonensequenz enthält, impfen Sie 150 ml LB-Brühe mit bakteriellen Glycerinvorräten, die das Template-Plasmid enthalten. Bei 37 °C mit Schütteln über Nacht oder bis die Kultur trüb ist. Reinigen Sie Plasmid-DNA aus der Bakterienkultur mit Ihrer Methode Ihrer Wahl.HINWEIS: Wir verwenden das McNary-Nagel Midi-Prep-Kit, um hohe Erträge an Plasmid-DNA zu erhalten. Um zu bestätigen, dass das Plasmid den erwarteten Einsatz enthält, führen Sie einen Restriktions-Digest durch und analysieren Sie die Produkte auf einem Agarose-Gel. Ungeschnittenes Plasmid kann auch auf einem Agarose-Gel analysiert werden, um auf genomische DNA-Kontamination zu überprüfen. Um die Schablonen-DNA linearisieren, richten Sie eine 100-L-Restriktions-Digest-Reaktion ein, die 20 g Plasmid-DNA, 2 l geeignetes Restriktionsenzym und 1x entsprechenden Puffer enthält. Bei 37 °C für mindestens 2 h inkubieren. Extrahieren Sie linearisierte DNA durch Durchführung einer Phenol-/Chlorformextraktion, gefolgt von einer Chloroformextraktion. Niederschlagen Sie DNA mit 100% Ethanol. Dies kann schnell geschehen, indem man der Probe zwei Mengen kaltes Ethanol hinzufügt und sie bei -80 °C inkubiert, bis sie sich erstarrt (15-30 min). Verwenden Sie eine gekühlte Zentrifuge, um DNA durch Spinnen für 20 min bei 12.000 x g/4 °C zu pellet. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 200 l 70% Ethanol. Drehen Sie 5 min bei 12.000 x g/4 °C. Das überstande und lufttrockene Pellet ca. 5 min entfernen. In 20 l 1x TE aufbewahren und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C lagern. Um die Antisense-RNA-Sonde zu synthetisieren und zu reinigen, erstellen Sie einen 2,5 mM rNTP-Mix, indem Sie 15 l mit 10 mM rCTP, 15 l mit 10 ml rGTP, 15 l von 10 mM rATP, 9,75 l mit 10 mM rUTP und 5,25 l mit 10 mM Dig-11 UTP (siehe Tabelle der Materialien)kombinieren. Richten Sie eine 50 l In-vitro-Transkriptionsreaktion ein, die 4 g linearisierte Vorlagen-DNA aus Schritt 4.2-4.10 enthält, 15 l mit 2,5 mM rNTP-Mischung aus Schritt 4,11, 10 l 5x Transkriptionspuffer, 5 l 0,1 M DTT, 0,5 l RNAse-Inhibitor (20 U/L) und 1,5 l geeigneter RNA-Polymerase (T3, T7 oder SP6). 1 h bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie der Reaktion eine zusätzliche RNA-Polymerase von 1,5 l hinzu und kehren Sie für eine weitere Stunde auf 37 °C zurück. Fügen Sie 1 l RQ1 DNAse zur Reaktion hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 min, um die DNA-Vorlage zu verschlechtern. Fügen Sie 30 L 7,5 M LiCl-Lösung zu probe. Pipette bei -20 °C mindestens 1 h mischen und inkubieren. Mit einer gekühlten Zentrifuge die Probe 25 min bei 14.000 x g/4 °C drehen. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 500 l 70% Ethanol. Drehen Sie 5 min bei 14.000 x g/4 °C. Entfernen Sie das überstande und lufttrockene Pellet für ca. 5 min. Resuspend in 20 l nukleasefreies Wasser. Erstellen Sie bei einem 10-fachen Sondenbestand, indem Sie die Probe im Hybridisierungspuffer auf eine Konzentration von 10 ng/L verdünnen (50% Formamid, 5x SSC (Saline-Natriumcitrat; 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 1 mg/ml Torul-RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardt-Lösung, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA und 100 g/ml Heparin). Bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung lagern. 5. Genexpressionsanalyse: Fluoreszenz In Situ Hybridisierung HINWEIS: Alle Waschungen sollten mit ca. 1 ml Lösung mit einer sterilen, individuell umwickelten Transferpipette durchgeführt werden. Die Pipette sollte beim Entfernen oder Hinzufügen von Lösung sanieren, und Waschungen sollten so schonend wie möglich durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass Zellen nicht von der Plattenoberfläche entfernt werden und verloren gehen. 1x PBS von der Platte entfernen (ab Schritt 3.10). Ersetzen Sie es durch frische 1x PBS und brüten Sie 5 min bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie 25 ml 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0) mit 62,5 l Essigsäureanhydrid. Gut mischen. Waschen Sie die Platte mit dieser Lösung für 10 min. Waschen Sie die Platte mit 1x SSC für 5 min. Waschen Sie die Platte mit 0,02 M HCl für 10 min, um Zellen zu permeabilisieren. 2x mit 1x PBS für je 5 min waschen. Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie 1 ml Hybridisationspuffer (50% Formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 1 mg/ml Torul-RNA, 0,1% Tween-20, 1x Denhardt-Lösung, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA und 100 g/ml Heparin) zur Platte hinzu. Mit Schütteln mindestens 6 h bei 60 °C bebrüten. Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer und ersetzen Sie die in Schritt 4.19 hergestellte 10-fache Mischung durch eine 1x RNA-Sondenlösung (verdünnt. Sense RNA Sonden können als Negativkontrolle verwendet werden. Mit Schütteln für 8-14 h bei 60 °C bebrüten. Entfernen Sie die Sonde und lagern Sie bei -20 °C.HINWEIS: 1x Sondenverdünnung kann bis zu dreimal wiederverwendet werden, bevor sie verworfen wird. Spülen Sie die Platte mit 0,2x SSC. Mit frischem 0.2x SSC für 1 h bei 60 °C waschen. Bewegen Sie die Platten auf Raumtemperatur und gleichnden Sie 5 min. Waschen Sie die Platte mit 0,2x SSC für 5 min. Waschen Sie die Platte mit 1x PBT für 15 min. Waschen Sie die Platte mit 2%H2O2 in 1x PBT (0,1% Triton-x-100) für 1 h.HINWEIS: Diese Lösung ist lichtempfindlich, daher sollte sie für jedes Experiment frisch gemacht und vor Licht abgeschirmt werden. Die Platten sollten während dieser Inkubation auch vor Licht geschützt oder vereitelt werden. Waschen Sie die Platte mit 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1%Tween-20) für 15 min. Verdünnen Sie das blockblockierende Reagenz auf 2% im Maleinsäurepuffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5). Blockieren Sie die Zellen in dieser Mischung für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Blockierlösung durch Anti-Digoxygenin-POD-Antikörper, der 1:1.000 in 2% Blocking Reagenz im Maleinsäurepuffer verdünnt wird. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Spülen Sie die Platte 3x mit 1x TBST. 4x mit 2 ml 1x TBST für mindestens 15 min pro Wäsche mit kontinuierlichem Schaukeln waschen. 2x mit 1x PBT mindestens 10 min pro Wäsche mit kontinuierlichem Schaukeln waschen. Cy3-konjugiertes Tyramid 1:25 in 1x PBT verdünnen. Waschen Sie die Platte mit 750 l dieser Verdünnung für 5 min.HINWEIS: Diese Lösung ist extrem lichtempfindlich, und Platten sollten für den Rest des Experiments vor Licht geesteht oder abgeschirmt werden, um eine Verschlechterung des Signals zu vermeiden. Fügen Sie dieser Lösung 2,5 l von 0,3 %H2O2 hinzu und inkubieren Sie mit kontinuierlicher Schaukelung für weitere 40 min bei Raumtemperatur. 4x mit 1x TBST für mindestens 15 min pro Wäsche mit kontinuierlichem Schaukeln waschen. Spülen Sie mit 1x PBT. Fixieren Sie die Zellen durch Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur in 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA und 1 mM MgSO4 in 3,7% Formaldehyd). Entfernen Sie die Lösung und ersetzen Sie sie durch 1x PBS. Bewahren Sie die Platten bis zur Weiterverarbeitung in einem vereitelten Behälter bei 4 °C auf. 6. Bildgebungszellen HINWEIS: Die Bildgebung wurde mit einem invertierten konfokalen Mikroskop durchgeführt. Platzieren Sie die Probenplatte auf der Mikroskopstufe, und richten Sie die in Schritt 3.1 vorgenommene Markierung an der Vorderseite der Bühne aus. Fokussieren Sie das Bild so, dass der gittergefütterte Deckblatt sichtbar ist, und passen Sie mithilfe des Rasterbildes in Schritt 3.4 als Referenz das Sichtfeld an das im Kalziumbild erfasste Sichtfeld an (Abschnitt 3). Erfassen Sie Hellfeldbilder sowohl des Rastergitters als auch der Zellen. Beleuchten Sie die Proben mit einem 595 nm TRITC Laser. Passen Sie die Verstärkungswerte an, um das Signal mit den Bildern von den negativen Kontrollzellen entsprechend vom Hintergrund zu unterscheiden, und erfassen Sie ein Standbild.HINWEIS: Idealerweise werden die Fluoreszenzspiegel im Hintergrund auf der Grundlage einer negativen Kontrollplatte bestimmt, die parallel zu einer nicht zielorientierten Sinn-RNA-Sonde verarbeitet wird. Die Gain-Einstellungen werden so eingestellt, dass diese Platte vollständig schwarz erscheint (entsprechend den Hintergrundebenen), und dann für andere Platten, die aus dieser experimentellen Charge abgebildet sind, konstant gehalten wird. 7. Datenverarbeitung HINWEIS: Die Datenverarbeitung wurde mit der Nikon Elements-Software durchgeführt. Öffnen Sie das 2 h Calciumbild aus Schritt 3.7. Identifizieren Sie die Pixel, die jeder einzelnen Zelle entsprechen, indem Sie Binär > Spot-Erkennung > Helle Fleckenauswählen. Stellen Sie sicher, dass der FITC-Kanal ausgewählt ist. Farbige Kreise werden über einzelnen Zellen angezeigt, nachdem diese Ebene generiert wurde. Passen Sie die Zellenverteilungs- und Größenparameter so an, dass so viele Zellen wie möglich erkannt und einem eindeutigen Bezeichner zugeordnet werden. Verfolgen Sie die Zellen über alle Frames des Bildes, indem Sie zu Ansicht > Analysesteuerelemente > Nachverfolgungsoptionennavigieren. Legen Sie 5 Frames als maximale Lücke zwischen Denspuren fest, löschen Sie Objekte, die weniger als 600 Frames zugeordnet sind, und wählen Sie die Option Lücken schließen aus. Wählen Sie Binärdateien nachverfolgen aus, um die Zellverfolgung auf das Bild anzuwenden. Nachdem die Zellen nachverfolgt wurden, löschen Sie manuell jedes Objekt, das nicht einer einzelnen Zelle entspricht (z. B. ein Zellklumpen). Datenpunkte sollten jedoch nicht von einer weiteren Analyse auf der Grundlage der Morphologie der Kalziumaktivitätsspur ausgeschlossen werden. Wählen Sie im Bildbereich Overlay anzeigen > Binäre Objekt-ID anzeigenaus. Scrollen Sie zum Ende des Bildes (Frame 901) und wählen Sie Bearbeiten > Ansichtsmomentaufnahme erstellen (8Bit RGB)> Aktueller Frame > OK. Dadurch wird eine Momentaufnahme des letzten Bildrahmens erstellt, wobei die zugehörige Binär-ID jeder Zelle sichtbar ist. Speichern Sie dieses Bild. Exportieren Von Zeitreihendaten, indem Sie alle Objekte auswählen, gefolgt von Daten nach Excel exportieren. Speichern Sie die Ausgabe als CSV-Datei. Öffnen Sie das FISH-Bild. Optimieren Sie die Spoterkennung wie in den Schritten 7.1–7.2, indem Sie den TRITC-Kanal anstelle des FITC-Kanals verwenden. Löschen Sie manuell alle falsch zugewiesenen Binärdateien, und wählen Sie dann Automatisierte Messergebnisse > Messung aktualisieren aus, um die Signalintensität jeder Zelle zu berechnen. Exportieren Sie einen Bildmomentaufnahme und eine Datentabelle, indem Sie die Schritte 7.5 und 7.6 wiederholen. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle, in der Spalte A mit FISH Binary ID und Spalte B mit DerCalcium Binary IDbeschriftet ist. Öffnen Sie die in den Schritten 7.5 und 7.7 exportierten Bilder. Zeichnen Sie für jedes im FISH-Bild (Schritt 7.7) identifizierte Objekt die Binär-ID in Spalte A auf. Suchen Sie dann die entsprechende Zelle im Kalziumbild (Schritt 7.5) und notieren Sie diese binäre ID in Spalte B. Zellen, die in beiden Bildern nicht sicher identifiziert werden können, sollten der Kalkulationstabelle nicht hinzugefügt werden.HINWEIS: Es kann hilfreich sein, ein Fotobearbeitungsprogramm wie Adobe Photoshop oder GIMP-Bildeditor zu verwenden, um beide Bilder zu öffnen, ein halbtransparentes Bild zu erstellen und es auf sein Partnerbild zu überlagern, um die beiden binären IDs, die jeder Zelle zugeordnet sind, leichter zu identifizieren und zu verknüpfen. Für jede identifizierte Zelle sammeln (entweder manuell oder mit einem Skript) ihre Zeitreihen-Calciumdaten (mit der Calcium Binary ID verknüpft und in Schritt 7.6 exportiert) und seine Genexpressionsdaten (mit der FISH Binary ID verknüpft und in Schritt 7.7 exportiert).ANMERKUNG: Nachgeschaltete Datenverarbeitung und -analyse können die Zusammenstellung dieser Daten in einer einzigen Datentabelle und die Anwendung einer Reihe von Analysetechniken umfassen, einschließlich Spike-Zählung, Fraktalanalyse und Markovian-Entropie, die es dem Prüfer ermöglichen, neuartige Muster der Calciumaktivität zu erkennen 17,18.