Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Ravian L. van Ineveld; Hendrikus C.R. Ariese; Ellen J. Wehrens; Johanna F. Dekkers; Anne C. Rios

doi:10.3791/60709

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Published: June 05, 2020

doi:

10.3791/60709

Ravian L. van Ineveld*^1,2,3, Hendrikus C.R. Ariese*^1,2,3, Ellen J. Wehrens^1,2,3, Johanna F. Dekkers*^1,2,3,4, Anne C. Rios*^1,2,3

¹Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, ²Department of Cancer Research, Oncode Institute,Hubrecht Institute-KNAW Utrecht, ³Cancer Genomics Center (CGC), ⁴Hubrecht Institute,Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and University Medical Center (UMC) Utrecht

Özet

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Abstract

La technologie organoïde, la culture in vitro 3D de tissus miniatures, a ouvert une nouvelle fenêtre expérimentale pour les processus cellulaires qui régissent le développement et la fonction des organes ainsi que la maladie. La microscopie de fluorescence a joué un rôle majeur dans la caractérisation de leur composition cellulaire en détail et en démontrant leur similitude avec le tissu dont ils proviennent. Dans cet article, nous présentons un protocole complet pour l’imagerie 3D haute résolution des organoïdes entiers sur l’étiquetage immunofluorescent. Cette méthode est largement applicable pour l’imagerie des organoïdes dont l’origine, la taille et la forme diffèrent. Jusqu’à présent, nous avons appliqué la méthode aux voies respiratoires, au côlon, aux reins et aux organoïdes hépatiques dérivés de tissus humains sains, ainsi qu’aux organoïdes de tumeur mammaire humaine et aux organoïdes de la glande mammaire de souris. Nous utilisons un agent de compensation optique, FUnGI, qui permet l’acquisition d’organoïdes 3D entiers avec la possibilité de quantification unicellulaire des marqueurs. Ce protocole de trois jours de la récolte d’organoïdes à l’analyse d’image est optimisé pour l’imagerie 3D à l’aide de la microscopie confocale.

Introduction

L’avancement de nouvelles méthodes de culture, telles que la technologie organoïde, a permis la culture des organes dans un plat¹. Les organoïdes se développent en structures tridimensionnelles (3D) qui ressemblent à leurs tissus d’origine car ils préservent les traits phénotypiques et fonctionnels. Les organoïdes sont maintenant essentiels pour aborder les questions biologiques fondamentales², la modélisation des maladies, y compris le cancer³, et l’élaboration de stratégies de traitement personnalisées⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Depuis le premier protocole pour générer des organoïdes dérivés de cellules souches intestinales adultes⁸, la technologie organoïde s’est étendue pour inclure un large éventail de tissus sains et cancéreux dérivés d’organes, y compris la prostate⁹, cerveau¹⁰, foie¹¹^,¹², estomac¹³, sein¹⁴^,¹⁵, endomètre¹⁶, glande salivaire¹⁷, goût bourgeon¹⁸, pancréas¹⁹, et rein²⁰.

Le développement des organoïdes a conséci avec l’essor de nouvelles techniques de microscopie volumétrique qui peuvent visualiser l’architecture du tissu de montage entier en 3D²¹^,²²^,²³^,²⁴. L’imagerie 3D est supérieure à l’imagerie traditionnelle de section tissulaire 2D dans la visualisation de l’organisation complexe des spécimens biologiques. L’information 3D s’avère essentielle pour comprendre la composition cellulaire, la forme cellulaire, les décisions relatives au destin cellulaire et les interactions cellule-cellule d’échantillons biologiques intacts. Les techniques de sectionnement optique non destructive, telles que la microscopie à balayage laser confocale ou multi-photon (CLSM et MLSM) et la microscopie de fluorescence des feuilles lumineuses (LSFM), permettent maintenant la visualisation combinée des deux détails fins, ainsi que l’architecture générale des tissus, au sein d’un seul spécimen biologique. Cette approche d’imagerie puissante offre l’occasion d’étudier la complexité structurelle qui peut être modélisée avec des organoïdes²⁵ et de cartographier la distribution spatiale, l’identité phénotypique et l’état cellulaire de toutes les cellules individuelles composant ces structures 3D.

Récemment, nous avons publié un protocole détaillé pour l’imagerie 3D haute résolution des organoïdes fixes et effacés²⁶. Ce protocole est spécifiquement conçu et optimisé pour le traitement des structures organoïdes délicates, par opposition aux méthodologies pour les grands tissus intacts tels que DISCO²⁷^,²⁸, CUBIC²⁹^,³⁰^,³¹, et CLARITY³²^,³³. En tant que telle, cette méthode est généralement applicable à une grande variété d’organoïdes dont l’origine, la taille, la forme et le contenu cellulaire diffèrent. En outre, par rapport à d’autres protocoles d’imagerie volumétrique qui nécessitent souvent beaucoup de temps et d’efforts, notre protocole est peu exigeant et peut être complété dans les 3 jours. Nous avons appliqué notre protocole d’imagerie 3D pour visualiser l’architecture et la composition cellulaire des systèmes organoïdes nouvellement développés dérivés de divers tissus, y compris les voies respiratoires humaines³⁴, rein²⁰, foie¹¹, et les organoïdes du cancer du sein humain¹⁵. En combinaison avec le traçage de lignée fluorescente multicolore, cette méthode a également été utilisée pour révéler la biopotence des cellules basales dans les organoïdes mammaires de souris¹⁴.

Ici, nous affinons le protocole en introduisant l’agent de compensation non toxique FUnGI³⁵. Le déblaiement FUnGI est réalisé en une seule étape d’incubation, est plus facile à monter en raison de sa viscosité et préserve mieux la fluorescence pendant le stockage. En outre, nous introduisons le sulfate de dodécyl de sodium (SDS) dans le tampon de lavage pour améliorer les colorations nucléaires ainsi qu’une méthode de montage à base de silicone pour faciliter la préparation des diapositives avant la microscopie. La figure 1 donne une vue d’ensemble graphique du protocole (figure 1A)et des exemples d’organoïdes à image 3D (figure 1B−D). En bref, les organoïdes sont récupérés à partir de leur matrice 3D, fixe et immunoétique, optiquement effacé, photographié à l’aide de la microscopie confocale, puis 3D rendu avec un logiciel de visualisation.

Protocol

L’utilisation d’organoïdes dérivés de souris était conforme aux normes réglementaires et a été approuvée par le Comité d’éthique animale de l’Institut Walter and Eliza Hall (WEHI). Tous les échantillons d’organoïdes humains ont été prélevés dans des biobanques par l’intermédiaire de la technologie organoïde Hubrecht (HUB, www.hub4organoids.nl). Les autorisations ont été obtenues par le Comité d’éthique médicale de l’UMCU de l’UMRECH de l’UMRECH de l’UMRECH de l’UMRECH de l’UMRECH de l’UMRE de l’UMCU de l’UMCU de l’UMCU de l’UMCU de l’UMCU de l’UMCU de l’UMCU afin d’assurer le respect de la Loi néerlandaise sur la recherche médicale impliquant des sujets humains et le consentement éclairé a été obtenu des donateurs le cas échéant. 1. Préparation des réactifs Pour préparer 4 % (w/v) de paraformaldéhyde (PFA), chauffer 400 mL de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à un peu moins de 60 °C dans un bain d’eau. Ajouter 20 g de poudre de PFA et dissoudre à l’aide d’un agitateur. Ensuite, ajouter quelques gouttes de 10 M NaOH. Laisser refroidir sur la glace et ajouter quelques gouttes de 10 M HCl pour ajuster le pH à 7,4. Rechargez avec PBS à 500 mL et aliquot (conserver à -20 °C pendant jusqu’à 2 mois).REMARQUE : Ne chauffez pas au-dessus de 60 °C pour éviter la dégradation de la PFA. Temps de préparation = 4 h. Pour préparer pbs avec Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), ajouter 1 mL de Tween-20 à 1 L de PBS (conserver à 4 °C pendant jusqu’à 4 semaines).REMARQUE : Temps de préparation = 10 min. Pour préparer 100 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique de 0,5 M (EDTA), ajouter 18,6 g d’EDTA et 2,5 g de NaOH à 80 mL dH2O. Ajuster le pH à 8 avec 1 M NaOH et remplir à 100 mL avec dH2O. Pour préparer 500 mL de 1 M Tris, dissoudre 60,55 g de Tris avec 42 mL de concentré (36−38%) HCl en 300 mL de dH2O. Ajuster le pH à 8 et remplir à 500 mL. Pour préparer le tampon de lavage organoïde (OWB), ajouter 1 mL de Triton X-100, 2 mL de 10% (w/v) SDS et 2 g d’albumine de sérum bovin (BSA) à 1 L de PBS (stocker à 4 °C jusqu’à 2 semaines).REMARQUE : Temps de préparation = 10 min. Pour faire 220 mL de FUnGI, mélanger 110 mL de glycérol avec 20 mL de dH2O, 2,2 mL de tampon Tris (1 M, pH 8,0) et 440 μL d’EDTA (0,5 M). Ajouter 50 g de fructose et mélanger à température ambiante (RT) dans l’obscurité jusqu’à dissolution. Lorsqu’il est clair, ajouter 49 g de fructose et mélanger jusqu’à dissolution. Ajouter ensuite 33,1 g d’urée et mélanger jusqu’à dissolution (conserver à 4 °C dans l’obscurité).REMARQUE : Ne chauffez pas car le fructose caramélise à des températures plus élevées. FUnGI se compose de 50% (v/v) glycérol, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM tris base, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fructose et 2,5 M urée. Temps de préparation = 1 jour. Pour préparer PBS-BSA (1% w/v), dissoudre 1 g de BSA dans 100 mL de PBS (conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines).REMARQUE : Temps de préparation = 10 min. 2. Récupération organoïde REMARQUE : Les étapes suivantes s’appliquent aux organoïdes cultivés dans l’extrait de membrane de sous-sol (BME) qui ont été cultivés dans une plaque de 24 puits d’une taille de 100−500 μm . Apirate le milieu de culture et laver 1x avec pbs glacé. Évitez de perturber la matrice 3D. Mettre la plaque sur de la glace et ajouter 1 mL de solution de récupération des cellules glacées (Table des matériaux)à chaque puits. Incuber 30−60 min à 4 °C sur un shaker horizontal (40 tr/min).REMARQUE : Les gouttelettes de matrice 3D doivent être complètement dissoutes. Enrobez une pointe de pipette de 1 mL de BSA en trempant dans 1% PBS-BSA et en faisant des pipes de haut en bas 2x. Ce revêtement empêchera les organoïdes de coller à la pointe. Pour enrober le côté intérieur d’un tube conique de 15 mL, remplissez-le de 5 ml de PBS-BSA à 1 %, inversez 2−3x et jetez le PBS-BSA.REMARQUE : Ce revêtement est nécessaire pour tous les consommables en plastique jusqu’à la fixation (étape 3.3). À l’aide d’une pointe enduite, resuspendez doucement le contenu du puits 5−10x et transférez les organoïdes dans des tubes enduits de 15 mL. Les organoïdes de différents puits ayant la même identité peuvent être mis en commun dans le même tube. Ajouter 1 mL de glace 1% PBS-BSA à chaque culture bien pour rincer et recueillir tous les organoïdes. Ajouter le PBS froid à 10 mL et tourner vers le bas pendant 3 min à 70 x g et 4 °C pour obtenir une pastle serrée sans couche visible de matrice 3D. Retirez soigneusement le supernatant. 3. Fixation et blocage Resuspendez soigneusement les organoïdes dans 1 mL de PFA glacé à l’aide d’une pointe enduite de 1 mL. Fixer à 4 °C pendant 45 min. Resuspendez doucement les organoïdes à mi-chemin dans le temps de fixation à l’aide d’une pointe enduite de 1 mL pour assurer une fixation uniforme parmi tous les organoïdes. Ajouter 10 ml de PBT glacé au tube, mélanger délicatement en inversant le tube, incuber pendant 10 min et tourner vers le bas à 70 x g,à 4 °C.REMARQUE : À partir de cette étape, le revêtement des pointes n’est généralement pas nécessaire car la plupart des types d’organoïdes ne collent pas à la pointe après fixation. Cependant, certains organoïdes peuvent nécessiter des plastiques enduits même après fixation. Bloquez les organoïdes en réutilisant le granulé dans l’OWB glacé (au moins 200 μL d’OWB par puits) et transférez les organoïdes dans une plaque de suspension de 24 puits.REMARQUE : Les Organoïdes d’une grande pastille peuvent être divisés sur plusieurs puits pour effectuer différentes colorations. Incuber à 4 °C pendant au moins 15 min. 4. Immunolabeling Pipette 200 μL d’OWB dans un puits vide pour servir de puits de référence.REMARQUE : L’immunolabeling peut également être effectué dans des plaques de 48 ou 96 puits afin de réduire l’utilisation d’anticorps. Toutefois, l’utilisateur doit être conscient que les performances de coloration et de lavage pourraient être réduites en raison du plus petit volume. Laisser les organoïdes s’installer au fond de la plaque.REMARQUE : Cela peut être vérifié à l’aide d’un stéréomicroscope et est facilité à l’aide d’un fond sombre. Inclinez la plaque à 45° et retirez l’OWB en laissant les organoïdes dans 200 μL d’OWB (utilisez bien la référence pour estimer 200 μL). Ajouter 200 μL d’OWB avec des anticorps primaires 2x concentrés (p. ex., E-cadhérine [1:400] et Ki67 [1:200] pour les résultats de la figure 1; kératine 5 [1:500], kératine 8/18 [1:0 200], MRP2 [1:50], et Ki67 [1:200] pour les résultats de la figure 2) et incuber toute la nuit à 4 °C tout en se balançant légèrement /secouant (40 tr/min sur shaker horizontal). Le lendemain, ajoutez 1 mL d’OWB. Laisser les organoïdes s’installer au fond de la plaque pendant 3 min. Retirer oWB en laissant 200 μL dans la plaque. Ajouter 1 mL d’OWB et laver 2 h avec un léger bascule/tremblement. Répétez l’étape 4.6 deux fois de plus. Laisser les organoïdes s’installer au fond de la plaque pendant 3 min. Retirer oWB en laissant 200 μL dans le puits. Ajouter 200 μL d’OWB avec des anticorps secondaires, des anticorps conjugués et des colorants 2x concentrés (p. ex., DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], souris-AF555 [1:500], phalloilin-AF647 [1:100] pour les résultats de la figure 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], rabbit-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] pour les résultats de la figure 2; DAPI [1:1000], phalloilin-AF647 [1:100] pour les résultats de la figure 3) et incuber pendant la nuit à 4 °C tout en se balançant légèrement / secouant. Le lendemain, répétez les étapes 4.5−4.7. Transférer les organoïdes dans un tube de 1,5 mL et tourner à 70 x g pendant 3 min. 5. Dégagement optique des organoïdes Retirez autant que possible l’OWB en pipetage sans perturber les organoïdes. Ajouter FUnGI (au moins 50 μL, RT) à l’aide d’une pointe de 200 μL avec l’extrémité coupée et resuspender doucement pour empêcher la formation de bulles. Incuber à RT pendant 20 min.REMARQUE : Le dégagement optique par FUnGI peut causer un rétrécissement mineur des tissus. Cela n’affectera pas la morphologie générale des organoïdes monocouches et multicouches; cependant, les organoïdes monocouches en forme sphérique avec de grands lumens peuvent s’effondrer. Le protocole peut être mis en pause ici et les échantillons peuvent être stockés à 4 °C (pendant au moins 1 semaine) ou à -20 °C (pendant au moins 6 mois). 6. Préparation de diapositives pour l’imagerie confocale Préparer une seringue de 10 mL avec un scellant en silicone (Table des matériaux). Attachez une pointe de 200 μL et coupez l’extrémité pour permettre un flux doux du silicone visqueux après avoir appuyé sur la seringue. Utilisez la seringue pour dessiner un rectangle de 1 cm x 2 cm au milieu d’une diapositive. Couper l’extrémité d’une pointe de 200 μL et transférer les organoïdes dans FUnGI au milieu du rectangle. Placez un couvercle sur le dessus. Pour minimiser les bulles d’air emprisonnées, placez d’abord le côté gauche du couvercle, puis abaissez lentement le couvercle de gauche à droite jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’air emprisonné, puis relâchez le couvercle.REMARQUE : Les espaceurs de taille simililar aux organoïdes peuvent être utilisés pour éviter qu’ils ne soient endommagés. Appliquez doucement une pression sur tous les bords du couvercle pour l’attacher fermement au scellant en silicone. La diapositive est maintenant prête pour l’imagerie.REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici et l’échantillon peut être stocké à 4 °C (pendant au moins 1 semaine) ou -20 °C (pendant au moins 6 mois). 7. Acquisition et traitement d’images À l’aide d’un microscope à balayage laser confocal(Table des matériaux),image de la diapositive avec un objectif multi-immersion 25x ou d’immersion d’huile 40x pour l’imagerie confocale. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants pour l’objectif 25x : cadre de mode d’analyse, taille du cadre 1024 x 1024, taille voxel 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, temps de séjour de pixel <2 μs, balayage bidirectionnel, numéro moyen 1, profondeur de bit 8. Pour réduire le photobleaching, utilisez une faible puissance laser (<5% en général, <10% pour la coloration faible). Utilisez le mode Z-stack pour définir les limites inférieures et supérieures et définissez la taille de l’étape Z sur la durée optimale. Lors de l’imagerie de grandes structures organoïdes ou de plusieurs organoïdes ensemble, utilisez le mode de carrelage avec 10% de chevauchement et indiquez la zone d’intérêt.REMARQUE : Avec ces paramètres, la taille des données d’un organoïde typique d’un diamètre de 300 μm est de 300 μm est de 1 Go. Pour les jeux de données de balayage de tuile, pointez les fichiers d’imagerie dans le logiciel accompagnés du microscope (Table des matériaux). Dans la section traitement, sélectionnez Couture comme méthode, choisissez Nouvelle sortie sous paramètres et sélectionnez le fichier à coudre. Appuyez sur Appliquer pour commencer à coudre. Obtenez une représentation rendue en 3D de l’imagerie sous l’onglet Vue 3D dans le logiciel d’imagerie (Table des matériaux)et optimisez par la suite les propriétés de luminosité, de contraste et de rendu 3D. Exportez des instantanés RGB des résultats sous forme de fichiers TIFF.

Representative Results

L’imagerie des organoïdes en 3D permet la visualisation de l’architecture, la composition cellulaire ainsi que les processus intracellulaires en détail. La technique présentée est peu exigeante et peut vraisemblablement être appliquée à un large éventail de systèmes organoïdes qui sont dérivés de divers organes ou espèces hôtes. La force de l’imagerie 3D par rapport à l’imagerie 2D est illustrée par des images d’organoïdes de la glande mammaire de souris qui ont été générés à l’aide de méthodes récemment publiées14. La couche centrale de ces organoïdes se compose de cellules luminales en forme de colonne K8/K18 et la couche externe contient des cellules basales k5 postives allongées (Figure 2A), qui récapitule la morphologie de la glande mammaire in vivo. Cette organisation polarisée est difficile à apprécier à partir d’une section optique 2D de ce même organoïde (Figure 2B, panneau intermédiaire). Un autre exemple d’une structure complexe impossible à interpréter sans information 3D est le réseau de canaliculi MRP2-positif qui facilitent la collecte du liquide biliaire des organoïdes du foie humain11 (Figure 2B). Cela illustre comment notre méthode permet la visualisation des caractéristiques structurelles essentielles des organoïdes. De plus, la qualité et la résolution obtenues permettent une segmentation semi-automatisée et une analyse d’image. Ainsi, le nombre total de cellules et la présence de marqueurs peuvent être quantifiés dans des sous-types cellulaires spécifiques dans des organoïdes entiers. Nous l’illustrons en segmentant les noyaux d’un organoïde entier contenant 140 cellules, dont 3 cellules affichent une forte positivité pour le marqueur du cycle cellulaire Ki67 (Figure 2C). Le canal DAPI est choisi comme canal source, et les segments sont générés sur la base d’une étape de seuil d’intensité et d’un diamètre de sphère de 10 μm. Les objets touchants sont divisés par région qui poussent à partir de points de semence. Enfin, un filtre de taille de 10 voxels est appliqué pour supprimer les petits segments induits par le bruit. Pour chaque segment représentant un noyau, l’intensité moyenne du canal Ki67 est ensuite exportée pour le traçage. Nous avons récemment développé l’agent de compensation optique FUnGI35, que nous avons maintenant intégré dans ce protocole pour affiner la transparence des organoïdes. FUnGI est facile à utiliser, car la compensation est facilement réalisée par une seule étape d’incubation après la coloration immunofluorescente. Un avantage supplémentaire de l’agent est sa viscosité, ce qui le rend plus facile pour la manipulation de l’échantillon pendant le montage de diapositives. Les échantillons fluorescents de FUnGI préservent leur fluorescence même lorsqu’ils sont stockés pendant plusieurs mois à -20 °C. Nous démontrons que FUnGI surpasse l’intensité de fluorescence non claire et le fructose-glycérol dans la qualité du signal fluorescent profondément dans l’organoïde (figure 3A,B),et que les organoïdes effacés par FunGI ont globalement augmenté l’intensité de fluorescence par rapport aux organoïdes non clairs (Figure 3C). En résumé, nous décrivons une technique d’imagerie 3D peu exigeante et reproductible pour l’acquisition de données volumétriques d’organoïdes immunolabeled. Ce protocole peut être facilement utilisé pour l’image d’une variété d’organoïdes, y compris ceux de souris et d’origine humaine, à partir de modèles sains et de la maladie. La préparation simple de l’échantillon peut être adaptée pour faciliter les microscopes fluorescents confocal, multi-photon et de feuille de lumière afin d’obtenir une résolution cellulaire à subcellulaire d’organoïdes entiers. Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole d’imagerie 3D haute résolution. Les organoïdes sont récupérés de leur matrice 3D. La fixation et le blocage sont effectués avant l’immunolabeling avec des anticorps et des colorants. Le déblaiement optique est réalisé en une seule étape à l’aide de l’agent de compensation FUnGI. Le rendu 3D des images peut être effectué à l’aide d’un logiciel d’imagerie. (A) Vue d’ensemble schématique de la procédure. (B) Image confocale 3D de montage entier dégagée d’un immunolabeled organoïde du côlon humain pour F-actin et E-cadhérine (E-cad) (objectif d’huile 25x). Barre d’échelle = 40 μm. (C) Image confocale 3D de montage entier effacée. Barre d’échelle = 20 μm. (D) Section optique agrandie d’un immunolabeloïde organoïde du côlon humain pour F-actin, E-cadhérine (E-cad) et Ki67 (objectif d’huile 25x). Barre d’échelle = 5 μm. Ce chiffre a été modifié par Dekkers et coll.26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : L’imagerie volumétrique visualise une architecture 3D complexe. Images confocales représentant des ensembles de données 3D à monture entière (panneau gauche), des sections optiques 2D (panneau central) et des zones 3D d’une région élargie (panneau de droite). (A) Un organoïde dérivé d’une seule cellule basale de la glande mammaire de souris illustrant l’organisation 3D des cellules basales mammaires allongées qui entourent les cellules luminales ou étiquetées pour K8/18, K5 et F-actin (compensation fructose-glycérol; objectif d’huile 25x). Les barres d’échelle représentent 55 μm (panneau gauche) et 40 μm (panneaux du milieu et de la droite). (B) Un organoïde de foie foetal humain avec un réseau 3D complexe de canaliculi MRP2-positif, étiqueté pour DAPI, MRP2 et F-actin (compensation de fructose-glycérol ; objectif d’huile 40x). Les barres d’échelle représentent 25 μm (panneau gauche) et 8 μm (panneaux du milieu et de la droite). (C) Image confocale 3D de montage entier d’un organoïde de foie foetal humain étiqueté avec DAPI et Ki67 (panneau gauche) et une image segmentée sur le canal DAPI utilisant le logiciel d’imagerie (panneau du milieu). Barre d’échelle = 15 μm. Graphique tracé représentant l’intensité moyenne du Ki67 dans toutes les cellules (segmentées par DAPI) de l’organoïde entier (140 cellules) (panneau droit). Ce chiffre a été modifié par Dekkers et coll.26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Compensation optique des organoïdes avec FUnGI. (A) Images représentatives d’organoïdes du côlon humain étiquetés avec F-actin (vert) et DAPI (gris) et photographiés sans compensation, effacés avec du fructose-glycérol ou effacés avec FUnGI (objectif d’huile 25x). Panneau gauche : rendu 3D de l’organoïde. Panneau droit : section optique de l’organoïde à 150 μm de profondeur. Pour l’état de « non-compensation », la luminosité de l’image a dû être augmentée par rapport aux conditions « fructose-glycérol » et « FUnGI » pour visualiser l’organoïde. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Ajustement de régression non linéaire montrant la diminution de l’intensité de DAPI avec l’augmentation de la profondeur Z pour différentes méthodes de compensation optique. Les valeurs représentent des intensités de cellules individuelles détectées par segmentation DAPI et sont normalisées à l’intensité moyenne de dapi des 50 premiers μm de l’organoïde. Pour éviter la sous-estimation de l’atténuation causée par des cellules plus brillantes sur les bords plus profonds et les structures en herbe, seules les régions centrales des organoïdes ont été analysées. (C) Trois organoïdes par condition de taille et de profondeur similaires vers le couvercle ont été photographiés à l’aide de réglages de microscope identiques. Les ensembles de données 3D complets étaient segmentés en une seule cellule sur le signal DAPI à des fins de comparaison. Graphique à barres montrant l’intensité moyenne des DAPI avec différentes méthodes de compensation sur les ensembles de données segmentés complets. Les données sont représentées comme moyennes ± SD. Les valeurs sont des intensités de >3800 cellules individuelles détectées par segmentation DAPI. = p < 0,0001, test Kruskal-Wallis avec les tests post-hoc de comparaison multiple à deux faces de Dunn. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ici, nous avons proposé un protocole détaillé pour l’imagerie 3D des organoïdes intacts avec résolution unicellulaire. Pour réussir ce protocole, certaines étapes critiques doivent être prises. Dans cette section, nous mettons en évidence ces étapes et fournissons des dépannages.

La première étape critique est la suppression de la matrice 3D. La plupart des organoïdes sont propagés in vitro avec l’utilisation de matrices qui imitent l’environnement extracellulaire in vivo pour améliorer la formation de structures 3D bien polarisées. La correction et la coloration subséquente dans la matrice 3D sont possibles, mais peuvent être désavantageuses pour la pénétration d’anticorps ou peuvent générer un signal de fond élevé (données non montrées). L’ablation efficace des matrices peut être influencée par le type de matrice, la quantité et la taille des organoïdes et la culture prolongée. Par conséquent, l’optimisation peut être nécessaire pour différentes conditions de culture. Pour les organoïdes cultivés dans le Matrigel ou le BME, une étape de 30 à 60 min dans la solution de récupération des cellules glacées est suffisante pour dissoudre la matrice sans endommager les organoïdes. En outre, l’ablation de la matrice 3D de soutien pourrait entraîner la perte de structures indigènes et la perturbation des contacts organoïdes avec d’autres types de cellules, par exemple lorsque les organoïdes sont co-cultivés avec des fibroblastes ou des cellules immunitaires. En outre, la fixation organoïde optimale est cruciale dans la préservation de l’architecture des tissus 3D, l’antigénicité des protéines et la minimisation de l’autofluorescence. La fixation de 45 min avec 4% de PFA à 4 °C est normalement suffisante pour l’étiquetage d’un large éventail d’organoïdes et d’antigènes. Cependant, une étape de fixation plus longue, jusqu’à 4 h, est généralement plus appropriée pour les organoïdes exprimant des protéines fluorescentes de journaliste, mais exigera l’optimisation pour différents fluorophores. Les temps de fixation inférieurs à 20 min sont insuffisants pour étiqueter correctement le F-actin à l’aide de sondes de phalloïdine. Un autre problème commun est la perte d’organoïdes pendant le protocole. Il est donc important (i) d’enrober soigneusement les pointes et les tubes de pipet avec 1% BSA-PBS comme décrit lors de la manipulation d’organoïdes non fixés pour les empêcher de coller aux plastiques, (ii) utiliser des plaques de faible adhérence ou de suspension pour éviter que l’échantillon ne colle à la plaque, et (iii) laisser suffisamment de temps pour que les organoïdes s’installent au fond de la plaque avant d’enlever soigneusement les tampons. Le fUngi visqueux de pipetage peut introduire des bulles. La manipulation de l’échantillon effacé à RT diminue la viscosité et améliore la facilité d’utilisation, minimisant ainsi la perte d’organoïdes. Alors que la plupart des organoïdes sont faciles à manipuler, les organoïdes cystiques avec un lumen agrandi ont une forte tendance à s’effondrer lors de la fixation avec 4% PFA ou une fois autorisé avec FUnGI. Cet effet peut être réduit, mais pas complètement empêché, en utilisant un fixatif différent (par exemple, la formaline ou PFA-glutaraldéhyde). Cependant, cela pourrait avoir un impact sur l’autofluorescence, la pénétration des anticorps et la disponibilité des épitopes. Lorsque les organoïdes cystiques apparaissent pliés après la compensation, il est conseillé de sauter l’étape de compensation et l’image par microscopie multi-photon, qui est moins entravée par la diffusion de la lumière. Enfin, l’obtention de toute la structure 3D des organoïdes peut être difficile et nécessite une distance minimale entre coverslip et organoïde. En outre, lorsque les organoïdes ont de la place pour se déplacer dans leur agent de montage, cela peut entraîner des décalages X et Y tout en enregistrant des données en Z-profondeur. L’utilisation de moins de scellant en silicone pendant la préparation de la diapositive peut résoudre le montage sous-optimal entre la glissière et la lame de microscope. Cependant, trop peu de silicone peut conduire à la compression organoïde et la perte de leur structure 3D inhérente. FUnGI améliore la manipulation du montage des glissières et la stabilité des organoïdes pendant l’imagerie, en raison de sa viscosité plus élevée.

Bien que ce protocole puisse être utilisé pour un large éventail d’applications pour étudier en profondeur le contenu cellulaire et l’architecture 3D des organoïdes intacts, certaines limitations devraient être prises en considération. Cette méthodologie est plutôt faible et prend du temps. En effet, les utilisateurs doivent garder à l’esprit que l’imagerie de grands organoïdes intacts en 3D nécessite à la fois le carrelage et l’acquisition d’échantillons en Z, conduisant à des temps d’acquisition prolongées. Une imagerie plus rapide pourrait être réalisée à l’aide d’actifs de microscope, y compris le scanner de disque résonnant ou de rotation, ou par la technologie de microscope de feuille de lumière²⁶. Une autre considération est que les marqueurs peuvent être exprimés hétérogènement entre les organoïdes différents du même échantillon. Par conséquent, plusieurs organoïdes devraient être acquis pour mieux capturer cette hétérogénéité organoïde dans la culture. Enfin, alors que la procédure complète de laboratoire humide est simple, le postprotrait des données nécessite des compétences dans les logiciels d’analyse d’images pour la visualisation et la quantification 3D, ainsi que des statistiques pour l’extraction de toutes les informations présentes dans le jeu de données.

Au cours de la dernière décennie, le domaine de l’imagerie en volume a beaucoup progressé, en raison à la fois du développement d’un large éventail d’agents de compensation optique et de l’amélioration des technologies de microscopie et de calcul²⁷^,³⁰^,³¹. Alors que dans le passé la plupart des études axées sur l’imagerie en grand volume des organes ou des tumeurs associées, plus récemment des méthodes pour les tissus plus petits et plus fragiles, y compris les structures organoïdes, ont été développés³⁶^,³⁷^,³⁸. Nous avons récemment publié une méthode simple et rapide pour l’imagerie des organoïdes à monture entière d’origine, de taille et de forme diverses au niveau des cellules simples pour le rendu 3D ultérieur et l’analyse d’image²⁶, que nous avons présenté ici avec quelques améliorations (par exemple, FUnGI, montage en silicone) et accompagné d’un protocole vidéo. Cette méthode est supérieure à l’imagerie classique en section 2D dans le décryptage de la morphologie cellulaire complexe et del’architecturetissulaire ( Figure 2 ) et facile à mettre en œuvre dans les laboratoires avec un microscope confocal. Avec de légères adaptations au protocole, les échantillons peuvent être rendus compatibles avec, super-résolution confocale, multi-photon ainsi que l’imagerie des feuilles de lumière, ce qui rend ce protocole largement applicable et fournit aux utilisateurs un outil puissant pour mieux comprendre la complexité multidimensionnelle qui peut être modélisé avec des organoïdes.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes très reconnaissants pour le soutien technique du Princess Máxima Center for Pediatric Oncology et de l’Institut Hubrecht et de Zeiss pour le soutien et les collaborations en imagerie. Toute l’imagerie a été réalisée au centre d’imagerie Princess Máxima. Ce travail a été soutenu financièrement par le Princess Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD a reçu le soutien d’une bourse mondiale Marie Curie et d’une subvention de la VENI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). L’ACR a reçu le soutien d’une subvention de départ du Conseil européen (CER).

Materials

1.5 ml safe-lock centrifuge tubes	Eppendorf	EP0030 120.094
2 ml safe-lock centrifuge tubes	Eppendorf	EP0030 120.094
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A3059
Cell recovery solution	Corning	354253
Confocal microscope	Zeiss	LSM880
Confocal microscope software ZEN	Zeiss	ZEN black/blue
Conical tubes 15 ml	Greiner Bio-One	5618-8271
Coverglass #1.5 24x60mm	Menzel-Glazer	G418-15
Coverglass #1.5 48x60mm	ProSciTech	G425-4860
DAPI	ThermoFisher	D3571	dilution 1:1000
Dissection Stereomicroscope	Leica	M205 FA
Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m	Scotch 3M
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)	Gibco	14190144	1x
EDTA	Invitrogen	15576-028
Focus Clear	CelExplorer	FC-101
Fructose	Sigma Aldrich	F0127
Glycerol	Boom	76050771.0500
Graduated Transfer Pipets	Samco	222-15
Horizontal shaker	VWR	444-2900
Hydrochloric acid (HCl)	Ajax Firechem.	265.2.5L-PL	10M stock solution, corrosive
Imaris software	Bitplane
Microscope slides Superfrost	ThermoFisher	10143352	ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500g	Hazardous
Phalloidin Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A22287	dilution 1:100-200
E-cadherin	ThermoFisher	13-1900	dilution 1:400
Ki-67	BD Biosciences	B56	dilution 1:200
Keratin 5	BioLegend	905501	dilution 1:500
Keratin 8/18	DSHB (University of Iowa)		dilution 1:200
MRP2	Abcam	ab3373	dilution 1:50
Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21208	dilution 1:500
Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555	ThermoFisher	A-31570	dilution 1:500
Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555	ThermoFisher	A-31572	dilution 1:500
Silicone Sealant	Griffon	S-200
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher	28312
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets	Merck Millipore	567530	10 M stock solution, corrosive
Suspension cell culture plates	Greiner Bio-One	662102	24-well
Tris	Fisher Scientific	11486631
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8532	Hazardous
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose	ThermoFisher	16520050
Urea	Sigma Aldrich	51456
Workstation	Dell

Referanslar

Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496 (2017).
Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).

Etiketler

Organoids 3D Imaging Single-cell Resolution Optical Clearing Sample Preparation Basement Membrane Extract Recovery Solution PBS-BSA Centrifugation Paraformaldehyde PBS-Tween 20 Organoid Washing Buffer

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

van Ineveld, R. L., Ariese, H. C., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids. J. Vis. Exp. (160), e60709, doi:10.3791/60709 (2020).