단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

마우스 유래 오르가노이드의 사용은 규제 기준에 부합하며 월터와 엘리자 홀 연구소(WEHI) 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 인간 오르가노이드 샘플은 허브레흐트 오르가노이드 기술(HUB, www.hub4organoids.nl)을 통해 바이오뱅크에서 회수되었습니다. 허가는 인간 과목법과 관련된 네덜란드 의학 연구를 준수하기 위해 HUB의 요청에 따라 UMC Utrecht (METC UMCU)의 의료 윤리위원회에 의해 얻어졌으며 적절한 경우 기부자로부터 통보 된 동의를 얻었습니다. 1. 시약 준비 4% (w/v) 파라포름알데히드(PFA)를 준비하려면 400mL의 인산염 완충식식염수(PBS)를 수조에서 60°C 이하로 가열한다. PFA 파우더 20g을 넣고 교반기로 녹입니다. 다음으로, 10 M NaOH의 몇 방울을 추가합니다. 얼음을 식히고 10 M HCl 몇 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정하십시오. PBS ~ 500mL 및 알리쿼트(최대 20°C에 보관)로 위로 올려보세요.참고: PFA의 분해를 피하기 위해 60°C 이상으로 가열하지 마십시오. 준비 시간 = 4 시간. Tween-20 (PBT)(0.1% v/v)으로 PBS를 준비하려면 1mL의 Tween-20 ~ 1 L 의 PBS를 추가하십시오 (최대 4 주 동안 4 ° C에 저장).참고: 준비 시간 = 10분. 0.5M 에틸렌디아민테트라아세틱산(EDTA)의 100mL를 준비하려면 EDTA 18.6g, NaOH 2.5g을 dH2O의 80mL에 넣고 1M NaOH로 pH를 8m NaOH로 조정하고 dH2O로 100mL로 채우한다. 1M 트리의 500mL를 준비하려면 42mL의 농축액(36-38%)으로 60.55g의 트리스를 녹입니다. HCl은 300mL의 dH2O.에서 pH를 8으로 조정하고 500mL로 채웁니다. 오가노이드 세척 버퍼(OWB)를 준비하려면 트리톤 X-100 1mL 1mL, SDS 10%(w/v) SDS 2m, 소세럼 알부민(BSA) 2g을 PBS 1L(최대 2주까지 저장)한다.참고: 준비 시간 = 10분. 220mL의 FUnGI를 만들려면 110mL의 글리세롤을 dH220mL, 트라이 버퍼 2.2mL(1M, pH 8.0) 및 EDTA(0.5M)의 440 μL을 혼합한다. 과당 50g을 넣고 실온(RT)에서 녹을 때까지 섞습니다. 클리어하면 과당 49g을 넣고 용해될 때까지 섞습니다. 그런 다음 33.1 g의 우레아를 넣고 용해 될 때까지 섞습니다 (어둠 속에서 4 °C에 보관하십시오).참고: 과당캐러가 더 높은 온도에서 캐러멜화되기 때문에 가열하지 마십시오. FUnGI는 50% (v/v) 글리세롤, 9.4% (v/v) dH2O, 10.6 mM 트라이베이스, 1.1 mM EDTA, 2.5 M 과당 및 2.5 M 우레아로 구성됩니다. 준비 시간 = 1 일. PBS-BSA(1%w/v)를 준비하려면 PBS 100mL에 BSA 1g을 녹입니다(최대 2주 까지 4°C에 저장).참고: 준비 시간 = 10분. 2. 오르가노이드 회복 참고: 다음 단계는 지하 막 추출물(BME)에서 재배된 오가노이드에 적용되어 100-500 μm 크기의 24개의 웰 플레이트에서 배양되었다. 배양 매체를 흡기하고 얼음처럼 차가운 PBS로 1x를 씻으세요. 3D 행렬을 방해하지 마십시오. 접시를 얼음 위에 놓고 각 웰에 얼음 차가운 세포 회수 용액(재료 표)의1 mL을 추가합니다. 수평 셰이커 (40 rpm)에 4 °C에서 30-60 분 인큐베이션.참고: 3D 매트릭스 액적은 완전히 용해되어야 합니다. 1% PBS-BSA에 찍어 2배 위아래로 파이펫을 하여 BSA로 1mL 파이펫 팁을 코팅합니다. 이 코팅은 오르가노이드가 팁에 달라붙는 것을 방지합니다. 15mL 원추형 튜브의 내부 측면을 코팅하려면 1 % PBS-BSA의 5 mL로 채우고 2-3 x를 반전시키고 PBS-BSA를 폐기하십시오.참고 : 이 코팅은 고정 (단계 3.3)까지 모든 플라스틱 소모품에 필요합니다. 코팅 된 팁을 사용하여, 부드럽게 잘 5-10x의 내용을 다시 중단하고 코팅 15 mL 튜브에 오르가노이드를 전송합니다. 동일한 정체성을 가진 다른 우물에서 오가노이드는 동일한 튜브로 풀로 풀수 있습니다. 모든 오르가노이드를 헹구고 수집하기 위해 각 문화에 얼음 차가운 1 % PBS-BSA 1 mL을 추가하십시오. 차가운 PBS를 10mL에 추가하고 70 x g 및 4 °C에서 3 분 동안 회전하여 3D 매트릭스의 가시 층없이 단단한 펠릿을 얻습니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다. 3. 고정 및 차단 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1mL의 얼음 차가운 PFA로 오가노이드를 조심스럽게 재중단합니다. 4°C에서 45분 동안 수정합니다. 코팅된 1mL 팁을 사용하여 고정 시간 중간에 유기체를 부드럽게 재페수아 모든 오르가노이드 중에서도 고정합니다. 튜브에 10mL의 얼음 차가운 PBT를 넣고 튜브를 반역하여 부드럽게 섞고, 10분 동안 배양하고, 4°C에서 70xg으로회전합니다.참고 : 이 단계에서 부터 대부분의 오르가노이드 유형이 고정 후 팁에 달라 붙지 않기 때문에 팁 코팅은 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나 일부 오르가노이드는 고정 후에도 코팅 된 플라스틱을 필요로 할 수 있습니다. 얼음차가운 OWB(웰당 OWB의 최소 200μL)에서 펠릿을 재연하여 오르가노이드를 차단하고 오르가노이드를 24개의 잘 서스펜션 플레이트로 옮춥니다.참고: 하나의 큰 펠릿에서 오가노이드는 다른 얼룩을 수행하기 위해 여러 우물에 분할 될 수있다. 적어도 15 분 동안 4 °C에서 배양하십시오. 4. 면역 라벨링 빈 우물에서 OWB의 파이펫 200 μL을 참조로 잘 작용합니다.참고: 면역 라벨링은 항체 사용을 줄이기 위해 48- 또는 96웰 플레이트에서 수행될 수도 있습니다. 그러나 사용자는 더 작은 부피로 인해 염색 및 세척 성능이 모두 저하될 수 있음을 알고 있어야합니다. 오르가노이드가 접시 의 바닥에 정착하도록 허용합니다.참고: 이것은 스테레오 현미경을 사용하여 확인할 수 있고 어두운 배경을 사용하여 쉽게 합니다. 플레이트를 45° 기울이고 OWB의 200 μL에서 오가노이드를 떠나는 OWB를 제거하십시오(참조를 잘 사용하여 200 μL을 추정합니다). 1차 항체 2x 농축(예: E-cadherin [1:400] 및 Ki67 [1:200]을 추가하여 도 1;각질 5 [1:500]의 결과를 위해 OWB의 200 μL을 추가합니다. 케라틴 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], 그리고 Ki67 [1:200] 그림 2의결과에 대 한 및 4°C에서 하룻밤 배양 하 고 약간 흔들기/흔들림 (수평 셰이커에 40 rpm). 다음 날 OWB 1mL을 추가합니다. 오르가노이드가 플레이트 바닥에 3분 동안 정착하도록 허용합니다. 플레이트에 200 μL을 남기는 OWB를 제거합니다. OWB 1mL을 넣고 부드러운 흔들림/흔들림으로 2h를 씻습니다. 4.6 단계를 두 번 더 반복합니다. 오르가노이드가 플레이트 바닥에 3분 동안 정착하도록 허용합니다. 잘 에 200 μL을 떠나 OWB를 제거합니다. 이차 항체, 공각된 항체 및 염료 2x 농축(예: DAPI [1:1000], 쥐-AF488 [1:500], 마우스-AF555 [1:500], 프할로이드-AF647 [1:100] 결과와 함께 Figure 1OWB의 200 μL을 추가합니다. DAPI [1:1000], 쥐-AF488 [1:500], 토끼-AF555 [1:500], 마우스-AF555 [1:500], 프할로이드-AF647 [1:100] 도 2의결과에 대한; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] 도 3의결과에 대 한 ) 및 약간 흔들기/흔들 면서 4°C에서 하룻밤 배양. 다음 날, 4.5-4.7 단계를 반복합니다. 오르가노이드를 1.5mL 튜브로 옮기고 70 x g에서 3 분 동안 회전합니다. 5. 오르가노이드의 광학 클리어링 오르가노이드를 방해하지 않고 파이프팅하여 OWB를 최대한 많이 제거하십시오. 200 μL 팁을 사용하여 FUnGI(최소 50μL, RT)를 추가하고 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 20 분 동안 RT에서 인큐베이션.참고: FUnGI에 의한 광학 클리어링은 경미한 조직 수축을 일으킬 수 있습니다. 이것은 단층 및 다층 오르가노이드의 일반적인 형태에 영향을 미치지 않습니다; 그러나, 큰 루멘을 가진 구형 모양단층 오르가노이드는 붕괴할 수 있습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있고 견본은 4°C (적어도 1 주 동안) 또는 -20°C (적어도 6 개월 동안)에서 저장될 수 있습니다. 6. 공초점 이미징을 위한 슬라이드 준비 실리콘실란트(재료표)로10mL 주사기를 준비한다. 200 μL 팁을 부착하고 주사기를 누른 후 점성 실리콘의 부드러운 흐름을 허용하기 위해 끝을 잘라냅니다. 주사기를 사용하여 슬라이드 중간에 1cm x 2cm의 직사각형을 그립니다. 200 μL 팁의 끝을 잘라 사각형의 중간에 FUnGI의 오르가노이드를 전송합니다. 커버슬립을 위에 놓습니다. 갇힌 기포를 최소화하기 위해 커버슬립의 왼쪽을 먼저 놓고, 갇힌 공기가 없을 때까지 커버슬립을 왼쪽에서 오른쪽으로 천천히 낮추고 커버슬립을 놓습니다.참고: 오가노이드크기의 시뮬라를 사용하는 스페이서는 이를 손상시키지 않도록 사용할 수 있습니다. 커버슬립의 모든 가장자리에 압력을 부드럽게 가하여 실리콘 실란트에 단단히 부착합니다. 이제 슬라이드가 이미징을 사용할 준비가 되었습니다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있고 견본은 4°C (적어도 1 주 동안) 또는 -20°C (적어도 6 개월 동안)에서 저장될 수 있습니다. 7. 이미지 수집 및 처리 공초점 레이저 스캐닝현미경(재료 표)을사용하여, 공초점 이미징을 위한 멀티 침수 25배 또는 오일 침지 40x 목표로 슬라이드를 이미지합니다. 25x 목표에 대한 다음 획득 설정을 사용합니다: 스캔 모드 프레임, 프레임 크기 1024 x 1024, 복셀 크기 332 nm x 332 nm x 1.2 μm, 픽셀 거주 시간 &2 μm, 픽셀 거주 시간 &2 μm, 양방향 스캐닝, 평균 번호 1, 비트 깊이 8. 광표백을 줄이려면 저레이저 전력(일반적으로 5%, 약한 염색시 lt;10%)을 사용하십시오. Z 스택 모드를 사용하여 하부 및 상한을 정의하고 Z 단계 크기를 최적으로 설정합니다. 큰 오르간구체 구조 또는 다중 오르가노이드를 함께 이미징할 때 10%가 겹치는 타일링 모드를 사용하여 관심 영역을 나타냅니다.참고: 이러한 설정을 사용하면 직경 & 300 μm의 일반적인 오르가노이드의 데이터 크기는 <1 GB입니다. 타일 스캔 데이터 세트의 경우현미경(재료 표)과함께 소프트웨어에 이미징 파일을 스티치합니다. 처리 섹션에서 는 스티치를 메서드로 선택하고 매개 변수에서 새 출력을 선택하고 스티치할 파일을 선택합니다. 스티치를 시작하려면 적용을 누릅니다. 이미징소프트웨어(재료 표)에서 3D 뷰 탭 하에서 이미징의 3D 렌더링 된 표현을 얻고 이후에 밝기, 대조 및 3D 렌더링 특성을 최적화합니다. 결과의 RGB 스냅샷을 TIFF 파일로 내보냅니다.