インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

マウス由来オルガノイドの使用は規制基準に準拠し、ウォルター・アンド・イライザホール研究所(WEHI)動物倫理委員会によって承認されました。すべてのヒトオルガノイドサンプルは、フブレヒトオルガノイド技術(HUB、www.hub4organoids.nlを介してバイオバンクから回収された。UMCユトレヒト医療倫理委員会(METC UMCU)は、ヒト被験者法に関するオランダ医学研究の遵守を確保するために、HUBの要請により取得され、必要に応じてドナーからインフォームド・コンセントを得た。 1. 試薬の調製 4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)を調製し、400mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を水浴中で60°C弱に加熱します。20gのPFA粉末を加え、撹拌機を使用して溶解します。 次に、10 M NaOH の数滴を追加します。氷の上で冷却し、7.4にpHを調整するために10 M HClの数滴を追加してみましょう。500 mLとアリコートにPBSを上げる(2ヶ月まで-20°Cで保管してください)。メモ:PFAの劣化を避けるために60°C以上に加熱しないでください。準備時間= 4時間。 Tween-20(PBT)(0.1%v/v)でPBSを準備するには、1 mLのTween-20から1 LのPBS(4°Cで最大4週間保存)を加えます。注意:準備時間= 10分。 0.5 Mエチレンアミン酢酸(EDTA)の100mLを調製するには、EDTAの18.6 gと2.5gのNAOHをdH2Oの80 mLに加え、pHを1M NaOHで8に調整し、dH2 Oで100mLに充填します。2 1 Mトリスの500 mLを調製するには、42 mLの濃縮(36-38%)で60.55 gのトリスを溶解します。HClを300mLのdH2O. pHを8に調整し、500 mLに充填します。 オルガノイド洗浄バッファー(OWB)を調製するには、トリトンX-100の1mL、10%(w/v)SDSの2mL、および2gのウシ血清アルブミン(BSA)を1 LのPBS(4°Cで2週間まで保存)を加える。注意:準備時間= 10分。 220 mLのFUnGIを作るために、20 mLのdH2Oとグリセロールの110 mL、トリスバッファーの2.2 mL(1 M,pH 8.0)およびEDTA(0.5 M)の440 μLを混合する。フルクトース50gを加え、暗闇の中で溶けるまで室温(RT)で混ぜます。クリアしたら、フルクトースを49g加え、溶かすまで混ぜます。その後、尿素33.1gを加え、溶かすまで混ぜます(暗闇の中で4°Cで保存)。注:フルクトースがより高い温度でキャラメル化するので加熱しないでください。FUnGIは50%(v/v)グリセロール、9.4%(v/v)dH2O、10.6 mMトリスベース、1.1 mM EDTA、2.5 Mフルクトースおよび2.5 M尿素で構成されています。準備時間= 1日。 PBS-BSA(1%w/v)を調製するために、1gのBSAをPBSの100mLに溶解する(4°Cで2週間まで保存する)。注意:準備時間= 10分。 2. オルガノイドの回復 注:以下の手順は、100-500 μmの大きさの24ウェルプレートで培養した基膜抽出物(BME)で成長したオルガノイドに適用されます。 培地を吸引し、氷冷PBSで1倍洗浄する。3D 行列を混乱させないようにします。 氷の上にプレートを置き、各ウェルに氷冷細胞回収液(材料表)の1mLを追加します。水平シェーカー(40 rpm)で4°Cで30-60分インキュベートします。注: 3D マトリックスの液滴は完全に溶解する必要があります。 1%PBS-BSAに浸し、2倍のピペットを上下に浸して、BSAで1 mLピペットチップをコーティングします。このコーティングは、オルガノイドが先端に付着するのを防ぎます。15 mL円錐状チューブの内側をコーティングするには、5 mLの1%PBS-BSAを充填し、2-3xを反転し、PBS-BSAを廃棄します。注:このコーティングは、固定(ステップ3.3)まで、すべてのプラスチック消耗品に必要です。 コーティングされた先端を使用して、ウェル5-10xの内容を静かに再中断し、オルガノイドをコーティングされた15 mLチューブに移します。同一の同一の同一性を有する異なる井戸からのオルガノイドは同じ管にプールすることができる。 各培養物に1mLの氷冷1%PBS-BSAを加えて、すべてのオルガノイドをすすいで収集します。 冷たいPBSを10 mLに加え、70 x g および4°Cで3分間スピンダウンし、3Dマトリックスの可視層のないタイトなペレットを得る。上清を慎重に取り除いてください。 3. 固定とブロッキング コーティングされた1 mLの先端を使用して、1 mLの氷冷PFAでオルガノイドを慎重に再懸濁します。 4°Cで45分間固定します。コーティングされた1 mLチップを使用して固定時間の途中でオルガノイドを穏やかに再懸濁し、すべてのオルガノイドの間でも固定を確保します。 チューブに10mLの氷冷PBTを加え、チューブを反転して軽く混ぜ、10分間インキュベートし、4°Cで 70xgでスピンダウンします。注:このステップ以降では、ほとんどのオルガノイドタイプが固定後に先端に固執しないので、チップのコーティングは一般的に必要ありません。しかし、一部のオルガノイドは、固定後でもコーティングされたプラスチックを必要とすることがあります。 氷冷OWB(1ウェルあたり少なくとも200 μLのOWB)でペレットを再懸濁してオルガノイドをブロックし、オルガノイドを24ウェルサスペンションプレートに移します。注:1つの大きなペレットからのオルガノイドは、異なる染色を行うために複数の井戸に分割することができます。 4°Cで15分以上インキュベートします。 4. 免疫標識 ピペット200 μLのOWBは、空の井戸に入り、参照ウェルとして機能します。注:免疫標識は、抗体の使用を減らすために48ウェルまたは96ウェルプレートで行うこともできます。ただし、ボリュームが小さいため、染色と洗浄の両方のパフォーマンスが低下する可能性があることに注意する必要があります。 オルガノイドがプレートの底に落ち着くようにします。メモ:これは、ステレオ顕微鏡を使用して確認することができ、暗い背景を使用して容易にします。 プレートを45°傾け、OWBの200 μLでオルガノイドを残してOWBを取り除きます(参照ウェルを使用して200 μLを推定します)。 一次抗体2x濃縮(例えば、E-カドヘリン[1:400]とKi67[1:200])を有する200μLのOWBを加え、 図1;ケラチン5[1:500]の結果を求め、 ケラチン8/18[1:200]、MRP2[1:50]、およびKi67[ 図2の結果については1:200])で一晩インキュベートし、軽く揺れ/揺れしながら4°C(水平シェーカーで40rpm)。 翌日、1 mL の OWB を追加します。 オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせる。プレートに200 μLを残すOWBを取り外します。1 mLのOWBを加え、軽い揺れ/揺れで2時間洗います。 ステップ 4.6 をさらに 2 回繰り返します。 オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせる。ウェルに200 μLを残すOWBを取り外します。 2次抗体を用いた200 μLのOWBを追加し、コンジュゲート抗体と2x濃縮色素(例えば、DAPI[1:1000]、ラットAF488[1:500]、マウス-AF555[1:500]、ファロロジン-AF647[1:100]の 結果を含む)DAPI [1:1000], ラットAF488 [1:500], ウサギ-AF555 [1:500], マウスAF555 [1:500], ファロイジン-AF647 [1:100] 図2の結果については;DAPI[1:1000]、ファロイジン-AF647[1:100]の結果を 図3)にし、軽く揺れながら4°Cで一晩インキュベートする。 翌日、ステップ 4.5-4.7 を繰り返します。 オルガノイドを1.5mLチューブに移し、70 x g で3分間スピンダウンします。 5. オルガノイドの光学的な除去 オルガノイドを破壊することなくピペッティングして、できるだけOWBを取り除く。 200 μL 先端をカットオフして FUnGI (50 μL、RT 以上) を追加し、気泡の形成を防ぐために緩やかに再中断します。RTで20分間インキュベートします。注:FUnGIによる光学的なクリアリングは、軽度の組織収縮を引き起こす可能性があります。これは、単層および多層オルガノイドの一般的な形態に影響を与えない。しかし、大きなルーメンを持つ球状の単層オルガノイドが崩壊する可能性があります。プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは4°C(少なくとも1週間)または-20°C(少なくとも6ヶ月間)に保存することができます。 6. 共焦点イメージング用のスライド準備 シリコンシーラント(材料表)で10 mLの注射器を準備してください。200 μL の先端を取り付け、端部を切り落とし、シリンジを押した後に粘性シリコーンの穏やかな流れを可能にします。スライドの中央に1 cm x 2 cmの長方形を描くために、注射器を使用します。 200 μL 先端の端部を切り取り、FUnGI のオルガノイドを長方形の中央に移します。 カバースリップを上に置きます。閉じ込められた気泡を最小限に抑えるには、最初にカバースリップの左側を置き、次に、閉じ込められた空気がなくなるまでカバースリップを左から右にゆっくりと下げ、カバースリップを放します。メモ:オルガノイドの大きさがシミリラーであるスペーサーは、損傷を防ぐために使用できます。 カバースリップの全てのエッジに静かに圧力をかけ、シリコーンシーラントにしっかりと取り付けます。これで、スライドのイメージングの準備が整いました。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは4 °C(少なくとも1週間)または-20 °C(少なくとも6ヶ月間)に保存することができます。 7. 画像の取得と処理 共焦点レーザー顕微鏡(材料表)を使用して、多浸25倍または油浸40倍の目的で共焦点イメージング用のスライドを画像化します。 25xの目的に対して、次の取得設定を使用します:スキャンモードフレーム、フレームサイズ1024 x 1024、ボクセルサイズ332 nm x 332 nm x 1.2 μm、ピクセルドウェル時間<2 μs、双方向スキャン、平均数1、ビット深度8。光の漂白を減らすには、低レーザーパワー(一般的に5%、弱い染色に対して<10%)を使用してください。 Z スタック モードを使用して下限と上限を定義し、Z ステップ サイズを最適に設定します。大きなオルガノイド構造または多臓器体を一緒にイメージングする場合は、10%のオーバーラップを持つタイリングモードを使用し、対象領域を示します。注: これらの設定では、直径が <300 μm の典型的なオルガノイドのデータサイズは <1 GB です。 タイル スキャン データセットの場合は、イメージング ファイルを顕微鏡と一緒にソフトウェアにステッチします ([材料表] )。処理セクションで、メソッドとして [ステッチ] を選択し、パラメータの下の [新規出力] を選択して、ステッチするファイルを選択します。 [適用] を押してステッチを開始します。 イメージング ソフトウェア (表) の[3D ビュー ] タブでイメージングの 3D レンダリング表現を取得し、その後、明るさ、コントラスト、3D レンダリング プロパティを最適化します。結果の RGB スナップショットを TIFF ファイルとしてエクスポートします。