单个细胞分辨率三维成像的有机体

使用小鼠衍生的有机体符合监管标准，并经沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所（WEHI）动物伦理委员会批准。所有人体器官样本都是通过Hubrecht有机物技术（HUB，www.hub4organoids.nl）从生物库中采集的。UMC Utrecht （METC UMCU） 医学伦理委员会应 HUB 的请求获得授权，以确保遵守《荷兰涉及人类主体的医学研究法》，并在适当时获得捐赠者的知情同意。 1. 试剂制备 为了在水浴中将4%（w/v）的甲状甲醛（PFA）加热400 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）至60°C以下。加入20克PFA粉末，使用搅拌器溶解。 接下来，添加几滴 10 M NaOH。让冰上冷却，并添加几滴 10 M HCl，将 pH 调整到 7.4。用 PBS 至 500 mL 和等分（在 -20°C 下储存长达 2 个月）。注：请勿加热至60°C以上，以免PFA降解。准备时间 = 4 小时。 要使用 Tween-20 （PBT） （0.1% v/v） 准备 PBS，请添加 1 mL 的 Tween-20 至 1 L 的 PBS（在 4 °C 下储存长达 4 周）。注：准备时间 = 10 分钟。 要准备 100 mL 的 0.5 M 乙酰乙酸 （EDTA），添加 18.6 g 的 EDTA 和 2.5 g 的 NaOH 至 80 mL 的 dH2O. 调整 pH 到 8 与 1 M NaOH，并填充到 100 mL 与 dH2O. 要准备 500 mL 的 1 M Tris，将 60.55 g Tris 溶解，浓度为 42 mL（36~38%）HCl 在 300 mL 的 dH2O. 调整 pH 到 8 和填充到 500 mL. 为了准备有机体洗涤缓冲液（OWB），加入1 mL的Triton X-100，2mL的10%（w/v）SDS和2克牛血清白蛋白（BSA）至1L的PBS（储存在4°C至2周）。注：准备时间 = 10 分钟。 要使 220 mL 的 FUNGI，混合 110 mL 的甘油与 20 mL 的 dH2O、2.2 mL 的 Tris 缓冲液 （1 M， pH 8.0） 和 440 μL 的 EDTA （0.5 M）。加入50克果糖，在黑暗中室温（RT）混合，直到溶解。当清除时，加入49克果糖并混合至溶解。然后加入33.1克尿素并混合至溶解（在黑暗中储存在4°C）。注：不要加热果糖焦糖在更高的温度下。FUNGI 由 50% （v/v） 甘油、9.4% （v/v） dH2O、10.6 mM 三叶基、1.1 mM EDTA、2.5 M 果糖和 2.5 M 尿素组成。准备时间 = 1 天。 为了准备PBS-BSA（1%w/v），在100 mL的PBS中溶解1克BSA（储存在4°C至2周）。注：准备时间 = 10 分钟。 2. 有机体恢复 注：以下步骤适用于在24孔板中培养的在24孔板中培养的在地下膜提取物（BME）中生长的器官，其尺寸为100~500μm。 吸培养培养，用冰冷的PBS洗1倍。避免破坏 3D 矩阵。 将板放在冰上，在每井中加入1 mL的冰冷细胞回收溶液（材料表）。在水平摇床（40 rpm）上，在4°C下孵育30~60分钟。注：3D 矩阵液滴应完全溶解。 在 1% PBS-BSA 中浸渍，上下移液 2 倍，将 1 mL 移液器尖端涂覆在 BSA 上。这种涂层将防止器官粘在尖端。要涂覆 15 mL 圆锥管的内侧，请填充 5 mL 的 1% PBS-BSA，反转 2~3 倍并丢弃 PBS-BSA。注：在固定之前，所有塑料耗材都有必要涂装（步骤 3.3）。 使用涂层尖端，轻轻重新暂停井的含量 5~10 倍，然后将管状物转移到涂层的 15 mL 管上。不同具有相同标识的井中的有机体可以汇集到同一管中。 在每个培养中加入1 mL的冰冷1%PBS-BSA，以冲洗和收集所有器官。 将冷 PBS 添加到 10 mL，在 70 x g 和 4 °C 下旋转 3 分钟 ，获得没有可见层 3D 矩阵的紧密颗粒。小心地取出上一液。 3. 固定和阻塞 使用涂层的 1 mL 尖端小心地将有机体重新在 1 mL 的冷 PFA 中。 在 4 °C 下固定 45 分钟。使用涂布的 1 mL 尖端在固定时间进行到固定时间的中途轻轻重新暂停器官，以确保所有器官之间的均匀固定。 将10 mL的冰冷PBT加入管子，轻轻混合，通过倒置管，孵育10分钟，在 70xg下旋转，均在4°C。注：从这一步开始，通常不需要涂覆尖端，因为大多数器官类型在固定后不粘在尖端上。然而，一些有机体可能需要涂层塑料，即使在固定后。 通过将颗粒重新悬浮在冰冷的 OWB 中（每井至少 200 μL OWB）中，将器官转移到 24 井悬浮板中，阻断器官。注：一个大颗粒中的有机体可以分裂到多个孔上，以进行不同的染色。 在4°C下孵育至少15分钟。 4. 免疫标记 流水器200μL的OWB在空井作为参考井。注：免疫标记也可以在48或96孔板中进行，以减少抗体的使用。但是，用户应该知道，由于体积较小，染色和洗涤性能可能会降低。 让器官在板的底部沉淀。注：这可以使用立体显微镜检查，并且通过使用深色背景更容易。 倾斜板 45°，并删除 OWB 离开有机体在 200 μL 的 OWB（使用参考井估计 200 μL）。 加入200μL的OWB，原抗体2x浓缩（例如，E-卡德林[1：400]和Ki67[1：200]，结果 图1;角蛋白5[1：500]， 角蛋白 8/18 [1：200]，MRP2 [1：50]，和 Ki67 [1：200]，用于图 2中的结果，并在 4 °C 下孵育过夜，同时轻微摇晃/摇动（水平摇床上 40 rpm）。 第二天，添加 1 mL 的 OWB。 让器官在板底沉淀3分钟。拆下 OWB，将 200 μL 留在板中。加入 1 mL 的 OWB，用轻微的摇动/摇动洗涤 2 小时。 再重复步骤 4.6 两次。 让器官在板底沉淀3分钟。拆下 OWB，在井中留下 200 μL。 加入200μL的OWB与二级抗体，结合抗体和染料2倍浓缩（例如，DAPI [1：1000]，大鼠AF488 [1：500]，小鼠-AF555 [1：500]，phaloidin-AF647 [1：100]， 用于图1的结果;DAPI [1：1000]，大鼠-AF488 [1：500]，兔子-AF555 [1：500]，鼠标-AF555 [1：500]，phaloidin-AF647 [1：100]， 图2的结果;DAPI [1：1000]，phoidin-AF647 [1：100]，用于图 3的结果，并在4°C下孵育过夜，同时轻微摇晃/摇晃。 第二天，重复步骤 4.5=4.7。 将器官转移到1.5 mL管中，以70 x g向下 旋转3分钟。 5. 有机体光学清除 在不干扰器官的情况下，通过移液尽可能去除 OWB。 使用端切口和轻轻重新暂停的 200 μL 尖端添加 FUnGI（至少 50 μL，RT）。在 RT 孵育 20 分钟。注：FUnGI的光学清除可能导致轻微的组织收缩。这不会影响单层和多层器官的一般形态;然而，球形单层器官与大流明可能会崩溃。协议可以在这里暂停，样品可以储存在4°C（至少1周）或-20°C（至少6个月）。 6. 共声成像的幻灯片准备 准备一个10毫升注射器与硅胶密封剂（材料表）。连接 200 μL 尖端并切断端，以便按下注射器后，粘性硅胶的温和流动。使用注射器在幻灯片中间绘制 1 厘米 x 2 厘米的矩形。 切断 200 μL 尖端的端，将 FUNGI 中的器官转移到矩形的中间。 将盖玻片放在顶部。为了最大限度地减少捕获的气泡，请先将盖玻片的左侧放置，然后从左到右缓慢降低盖玻片，直到没有被困空气，然后松开盖玻片。注：与器官大小相当的分位器可用于防止其受损。 轻轻对盖玻片的所有边缘施加压力，将其牢固地连接到硅胶密封剂上。幻灯片现已准备好进行映像。注：协议可以在这里暂停，样品可以储存在4°C（至少1周）或-20°C（至少6个月）。 7. 图像采集和处理 使用共声激光扫描显微镜（材料表），用多浸入式25倍或油浸40倍的镜面对幻灯片进行成像。 对 25 倍目标使用以下采集设置：扫描模式帧、帧大小 1024 x 1024、体母体尺寸 332 nm x 332 nm x 1.2 μm、像素停留时间 <2 μs、双向扫描、平均数 1、位深度 8。要减少光漂白，请使用低激光功率（一般为<5%，弱染色为<10%）。 使用 Z 堆栈模式定义下限和上限，并设置 Z 步进大小为最佳。当一起成像大型器官结构或多个器官时，使用10%重叠的平铺模式，并指示感兴趣的区域。注：使用这些设置，直径为 <300 μm 的典型器官的数据大小为 <1 GB。 对于切片扫描数据集，将图像文件与显微镜（材料表）一起拼接在软件中。在处理部分中， 选择拼接 作为方法，在参数 下选择 “新输出”，然后选择要缝合的文件。按 “应用 “开始缝合。 在成像软件（材质表） 的3D视图选项卡下获取图像的3D 渲染表示，然后优化亮度、对比度和3D渲染属性。将结果的 RGB 快照导出为 TIFF 文件。