Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

O perfil transcricional de cada célula varia entre as populações celulares durante o desenvolvimento embrionário. Embora a hibridação in situ molecular única possa ser usada para visualizar a expressão de um pequeno número de genes^1,o sequenciamento de mRNA de célula única (scRNA-Seq) fornece uma abordagem imparcial para ilustrar padrões de expressão em todo o genoma de genes em células únicas. Depois que foi publicado pela primeira vez em 2009^2,scRNA-Seq foi aplicado para estudar vários tecidos em vários estágios de desenvolvimento nos últimos anos^3,4,5. Além disso, como o atlas de células humanas lançou seus projetos focados no desenvolvimento recentemente, mais dados de células únicas de tecidos embrionários humanos devem ser gerados em um futuro próximo.

O coração como o primeiro órgão a desenvolver desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário. O coração consiste em tipos múltiplos da pilha e o desenvolvimento de cada tipo da pilha é temporal e espacial firmemente regulado. Ao longo dos últimos anos, a origem e linhagem celular de células cardíacas em estágios iniciais de desenvolvimento têm sido caracterizadas⁶, que fornecem uma tremenda ferramenta de navegação útil para a compreensão da patogênese congênita da doença cardíaca, bem como para o desenvolvimento de métodos tecnologicamente mais avançados para estimular a regeneração cardiomiócito⁷.

O scRNA-Seq passou por uma rápida expansão nos últimos anos^8,9,10. Com os métodos recém-desenvolvidos, o projeto e a análise de experimentos unicelulares tornaram-se mais alcançáveis^11,12,13,14. O método apresentado aqui é um procedimento comercial baseado nas soluções de gotículas (ver Tabela de Materiais)^15,16. Este método apresenta a captura de células e conjuntos de contas de código de barras únicas em uma gota de emulsão de água de óleo controle de um sistema de controlador microfluídico. A taxa de carregamento celular nas gotículas é extremamente baixa, de modo que a maioria das emulsões de gotículas contenha apenas uma célula^17. O projeto engenhoso do procedimento vem da separação da única pilha em emulsões da gotícula que ocorrem simultaneamente com código de barras, que permite a análise paralela de pilhas individuais usando RNA-Seq em uma população heterogeneous.

A incorporação de estratégias multiplexing é uma das adições importantes ao fluxo de trabalho tradicional de célulaúnica^13,14. Esta adição é muito útil no descarte de dobradores celulares, reduzindo os custos experimentais e eliminando os efeitos do lote^18,19. Uma estratégia de código de barras baseada em lipídios e uma estratégia de código de barras baseada em anticorpos (ver Tabela de Materiais)são os dois métodos multiplexing usados principalmente. Códigos de barras específicos são usados para rotular cada amostra em ambos os métodos, e as amostras rotuladas são então misturadas para captura de célulaúnica, preparação da biblioteca e sequenciamento. Posteriormente, os dados de sequenciamento agrupados podem ser separados analisando as sequências de código de barras(Figura 1)¹⁹. No entanto, existem diferenças significativas entre os dois métodos. A estratégia de código de barras baseada em lipídios é baseada em oligonucleotídeos modificados por lipídios, que não foram encontrados para ter qualquer preferência do tipo celular. Enquanto a estratégia de código de barras baseada em anticorpos só pode detectar as células que expressam as proteínas de antígeno^19,20. Além disso, leva cerca de 10 min para manchar os lipídios, mas 40 min para manchar os anticorpos (Figura 1). Além disso, os oligonucleotídeos modificados por lipídios são mais baratos do que os oligonucleotídeos conjugados com anticorpos, mas não comercialmente disponíveis no momento da escrita deste artigo. Finalmente, a estratégia baseada em lipídios pode multiplex 96 amostras em um experimento, mas a estratégia baseada em anticorpos atualmente só pode multiplex 12 amostras.

O número de células recomendado para multiplex em um único experimento deve ser inferior a 2,5 x 10⁴, caso contrário, levará a uma alta porcentagem de dobradores celulares e potencial contaminação por mRNA ambiente. Através das estratégias multiplexing, o custo de captura de célulaúnica, geração de cDNA e preparação da biblioteca para várias amostras será reduzido ao custo de uma amostra, mas o custo de sequenciamento permanecerá o mesmo.