Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.
De afscheiding van kleine membraangebonden blaasjes in de externe omgeving is een fundamenteel fysiologisch proces van alle cellen. Deze extracellulaire blaasjes (EV’s) functioneren buiten de cel om wereldwijde fysiologische processen te reguleren door eiwitten, nucleïnezuren, metabolieten en lipiden tussen weefsels over te brengen. EV’s weerspiegelen de fysiologische toestand van hun cellen van oorsprong. EV’s zijn betrokken om fundamentele rollen te hebben in vrijwel elk aspect van de menselijke gezondheid. Zo worden EV-eiwit en genetische ladingen steeds vaker geanalyseerd op biomarkers van gezondheid en ziekte. Het EV-veld mist echter nog steeds een hardnekkig ongewerveld modelsysteem dat de studie van ev-ladingsamenstelling mogelijk maakt. C. elegans is zeer geschikt voor EV-onderzoek omdat het actief EV’s buiten zijn lichaam in zijn externe omgeving scheidt, waardoor facile isolatie mogelijk is. Dit artikel biedt alle nodige informatie voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van deze milieuvriendelijke c. elegans EV’s, waaronder hoe kwantitatief te werken met zeer grote populaties van leeftijdsgesynchroniseerde wormen, zuiverende EV’s, en een flow cytometrie protocol dat direct meet het aantal intacte EV’s in de gezuiverde steekproef. Zo kan de grote bibliotheek van genetische reagentia beschikbaar voor C. elegans onderzoek worden aangeboord voor het onderzoeken van de effecten van genetische paden en fysiologische processen op EV lading samenstelling.
De afscheiding van membraangebonden extracellulaire blaasjes (EV’s) vergemakkelijkt de wereldwijde fysiologische processen door actief specifieke eiwitten, nucleïnezuur, metaboliet en lipideladingen tussen cellen1te transporteren. Cellen scheiden EV’s af die een continuüm van grootte sen van 2 μm of groter tot zo klein als 20 nm2. Kleine EV’s (<200 nm) worden steeds vaker bestudeerd vanwege hun implicaties in pathologische processen, waaronder stofwisselingsstoornissen, kanker, hart- en vaatziekten en neurodegeneratieve ziekten3,4,5. Deze pathologieën hebben ook aangetoond dat ze de eiwit- en genetische samenstelling van EV’s-ladingen van kleine EV’s beïnvloeden. Daarom worden biomarker-handtekeningen van de pathologie steeds vaker blootgelegd via EV-ladingsdetectiemethoden zoals LC-MS-MS en RNAseq6,7,8,9.
C. elegans is een nuttig ongewerveld model voor het identificeren van evolutionair geconserveerde EV signalering seinen trajecten. Bijvoorbeeld, een C. elegans flippase werd voor het eerst aangetoond dat de EV biogenese induceren in C. elegans embryo’s, en de menselijke homolog bleek te beïnvloeden EV release in menselijke cellen10,11. C. elegans EV’s werden gemeld aan Egel signalen die nodig zijn voor cuticula ontwikkeling te dragen. De levering van Egel en andere morfogenen werd getoond om een belangrijke ontwikkelingsrol van EV’s te spelen, en het wordt bewaard in zebravissen, muizen, en mensen12,13,14,15. C. elegans is zeer geschikt voor EV biomarker ontdekking omdat het scheidt EV’s buiten zijn lichaam die functie in dier-tot-dier communicatie16,17 (Figuur 1A). De methode die in het licht van een eerdere studie is vastgesteld, kan echter niet worden gebruikt omdat de e. coli-voedselbron van de aaltjes ook EV’s18 scheidt. Bij deze methode bestaat het grootste deel van het monster uit E. coli-besmetting, waardoor de kracht van proteomische of RNAseq-benaderingen voor de ontdekking van C. elegans EV-ladingen wordt beperkt. De hier beschreven methoden werden ontwikkeld om zeer zuivere C. elegans EV’s op overvloedniveaus te leveren die kenmerkend zijn voor typische celkweekexperimenten en zo omics benaderingen voor EV biomarker ontdekking te vergemakkelijken.
Grote populaties wormen zijn nodig om een voldoende aantal EV’s te genereren voor ladinganalyse. Daarom zijn ook methoden voor het uitvoeren van kwantitatieve teelt van grote populaties ontwikkelingss gesynchroniseerde C. elegans opgenomen. Typisch, wanneer een groot aantal wormen nodig zijn voor experimenten, worden ze gekweekt in vloeibare media. Hoewel dit effectief is voor het genereren van grote populaties wormen, is de fysiologie van de dieren aanzienlijk anders dan wormen die onder standaardomstandigheden op nematodengroeimedium (NGM) agarplaten worden gekweekt. Dieren gekweekt in vloeistof groeien langzamer, zijn dunner, vertonen ontwikkelingsheterogeniteit en worden onderworpen aan een hoge mate van batchvariabiliteit. Daarom presenteren we een eenvoudig maar effectief middel voor de kwantitatieve teelt van grote populaties ontwikkelingss gesynchroniseerde C. elegans met behulp van 10 cm hoge groeiplaten. De mediasamenstelling van hoge groeiplaten omvat meer pepton dan gewone NGM-platen en is ingezaaid met de E. coli-stam NA22 die robuuster groeit dan OP50.
De vooruitgang in de technologie van de stroomcytometrie (FACS) heeft de directe analyse van individuele EV’s20,21, mogelijk gemaakt om EV’s te kwantificeren zonder de inherente beperkingen in andere methoden. Eerder werk heeft aangetoond dat eiwit is niet een nuttige proxy voor EV overvloed, omdat verschillende zuivering methoden resulteren in aanzienlijk verschillende EV-to-protein ratio’s22. Extreem zuivere EV-breuken bevatten relatief weinig eiwitten, waardoor het moeilijk is om monsters te kwantificeren met BCA- of Coomassiegels. Westerse analyse kan relatieve verschillen van individuele eiwitten identificeren, maar kan niet identificeren hoeveel EV’s er in het monster zitten. Robuuste kwantificering van ev-aantal door nanodeeltjestrackinganalyse wordt belemmerd door het smalle signaal-naar-ruisbereik, het onvermogen om onderscheid te maken tussen EV’s en vaste aggregaten, en het gebrek aan overdraagbaarheid van methoden tussen instrumenten met verschillende specificaties23. Daarom bevat dit artikel ook een generalizable flow cytometrische procedure voor het discrimineren en kwantificeren van EV’s.
Een fundamentele uitdaging van het EV-veld is het scheiden van de grote verscheidenheid aan EV-subtypes2. De hier beschreven methoden gebruiken filtratie, differentiële centrifugatie en grootte-uitsluitingchromatografie om een zuivere populatie van kleine EV’s te genereren, omdat ~100 nm EV’s eerder werden afgescheiden in de externe omgeving en functioneren in fysiologisch relevante communicatietrajecten16. EV’s gezuiverd door middel van grootte-uitsluiting chromatografie kan nog steeds een mengsel van exosomen en kleine microvesicles, omdat deze EV subklassen zijn even groot. Gewervelde EV-subklassen worden vaak gescheiden door immunoneerslag omdat deze methode EV’s isoleert door binding aan selectieve membraaneiwitmarkers. De beschreven methoden vergemakkelijken de identificatie van C. elegans EV membraan marker eiwitten. Daarom kan het in de toekomst mogelijk zijn om kleine EV-subklassen verder te scheiden door middel van analoge immunoneerslagmethoden. In theorie kan immunoneerslag EV’s isoleren van goed gevoede wormen omdat E. coli EV’s niet met het antilichaam zouden moeten communiceren. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van de eiwit- en genetische ladingen van grotere EV-subklassen (>200 nm) kunnen dit doen door de 0,22 μm filtratiestap over te slaan en vervolgens de pellet te analyseren in plaats van de supernatant. Het blootleggen van de eiwit- en genetische ladingsovervloed van grote EV’s zal een uitgebreider begrip van de fysiologische processen die functioneren via de C. elegans secretome. Naast het feit dat ze in de omgeving worden uitgescheiden, worden De elegans EV’s intern tussen weefsels overgedragen. Daarom isoleren deze methoden alleen een subset van de totale C. elegans EV’s. Het ontdekken van lading van interne EV’s is echter niet mogelijk omdat er geen methode is om EV’s te scheiden van lysed wormen. Cargo analyse van deze extern geheime EV subset biedt een middel om potentiële algemene EV eiwit markers kunnen labelen interne EV’s ook te identificeren.
De omvang van de EV voorbereiding zal afhangen van de eisen van het experiment. Een totaal van 500.000 jonge volwassenen biedt genoeg EV’s voor het uitvoeren van flow cytometrie, LC-MS-MS, en RNAseq analyse parallel. Dit aantal kan worden opgeschaald of omlaag, afhankelijk van de experimentele behoeften. De grootste praktische factor voor het opschalen is het aantal benodigde 10 cm hoge groeiplaten. Hoge groeiplaten bereid met 500 μL van 20x geconcentreerde ‘s nachts NA22 cultuur zal een bevolking van ~ 50.000 volwassenen te ondersteunen van de L1 larve stadium tot de eerste dag van volwassenheid. Daarom zijn er 13 hooggroeiplaten nodig om een experiment uit te voeren met 500.000 volwassenen: één plaat om de populatie L1’s te genereren, twee platen om de volwassenen te laten bleken en 10 platen voor de groei van de proefdieren. Deze statistieken zijn afhankelijk van de zaai- en bacteriële groeiomstandigheden van de hoge groeiplaten. Daarom wordt aanbevolen om alle platen op een gestandaardiseerde manier te maken en vervolgens te kalibreren met bekende hoeveelheden dieren.
Wormen worden geteld in twee stadia tijdens het teeltproces: 1) voor het zaaien van wormen op platen en 2) voordat het genereren van de geconditioneerde media. De dichtheid van de dierlijke cultuur is getoond om gedrag, ontwikkeling, en spanningsreacties15,16,17,,18 te beïnvloeden en kan daarom ook EV ladingen beïnvloeden., Daarom is het voor een consistente teeltdichtheid noodzakelijk om wormpopulaties nauwkeurig te schatten. Het kwantificeren van het aantal wormen in negen druppels geeft statistisch vertrouwen van bevolkingsschattingen. Het is essentieel om elke druppel individueel te behandelen, vortexing tussen elke druppel en het invoegen van de pipet dezelfde afstand in de worm schorsing. Het nemen van deze voorzorgsmaatregelen zal ervoor zorgen S.E.M. waarden van ~ 5-10% van de totale bevolking. Als de S.E.M. voor een wormpopulatie hoger is dan 20%, dan ging er iets mis.
Na de 24 uur bacterievrije incubatietijd kruipen jonge, wilde type C. elegans onmiddellijk bij toevoeging aan een bacterieel gazon. Dit geeft aan dat de incubatie geen ernstige gevolgen heeft voor hun gezondheid. Deze stap heeft echter wel invloed op de fysiologie van de dieren en kan daarom de samenstelling van de EV-ladingen beïnvloeden. Daarom is het bij het werken met zeer zieke genotypen of oudere dieren essentieel om de levensvatbaarheid na de incubatiestap te controleren. Als alle dieren de incubatie niet overleven, verhoog dan de experimentele populatiegrootte en verklein de incubatietijd. Bij het werken met grote hoeveelheden geconditioneerde media is het praktischer om een geroerde celconcentrator te gebruiken met een filter gemaakt van geregenereerde nitrocellulose. EV’s binden zich niet zo sterk aan deze filterchemie als andere filtertypen14.
De verhouding tussen het totale eiwit dat uit de geconditioneerde media wordt teruggewonnen met het aantal dieren dat is geïncubeerd om het preparaat te maken, is een nuttige statistiek. Als deze verhouding veel hoger is dan verwacht, dan is het mogelijk dat de bevolkingsschattingen waren uitgeschakeld of dat dieren stierven en verslechterden in de geconditioneerde media. Als deze verhouding veel lager is dan verwacht, dan kan sommige eiwitten verloren zijn gegaan op de filters tijdens het concentratieproces. Hoewel de FACS-methoden de EV’s in de voorbereiding direct zullen kwantificeren, is deze statistiek nuttig omdat deze afwijkingen in het proces in een vroeg stadium kan markeren. Een andere nuttige methode voor het verifiëren van de kwaliteit van het EV-preparaat is transmissieelektronenmicroscopie, zoals blijkt uit figuur 4D. Hoewel het protocol voor transmissie elektronenmicroscopie is niet formeel opgenomen in deze methoden artikel als gevolg van lengte, het kan worden uitgevoerd door standaard methoden. Het wordt aanbevolen om dit soort analyses uit te voeren, althans in eerste instantie, als een gratis methode voor FACS voor de beoordeling van de kwaliteit van EV-preparaten. Voor de beste resultaten gebruik maken van vers geloosde formvar-carbon roosters en vlek de monsters met 2% fosforwolfraamzuur in plaats van uranyl acetaat.
DI-8-ANEPPS werd gekozen omdat het is aangetoond dat het kwantitatief label EV membranen, beter dan andere algemene EV kleurstoffen met menselijke biopsie monsters en liposomen25. De metingen zijn snel, waarbij slechts 3 min van de inzameltijd voor elk monster. De kwantificering van wasmiddelgevoelige EV’s heeft een directe functionele betekenis omdat het inspeelt op een fundamenteel fysiek onderscheid tussen EV’s en vaste lipoproteïneaggregaten. Belangrijk is dat deze methode niet wordt beïnvloed door de hoeveelheid totale eiwitten of het aantal niet-EV aggregaten en kan daarom EV’s die via verschillende zuiveringsmethoden worden verkregen op een onbevooroordeelde manier kwantificeren. De FACS-geverifieerde EV-statistiek die we hier beschrijven zou vooral nuttig zijn voor studies die fysiologische effecten van gezuiverde EV’s aantonen. Het zou ook ten goede kunnen komen aan het EV-veld in het algemeen om een FACS-methodologie vast te stellen als een universele statistiek, zodat absolute EV-overvloeden direct kunnen worden vergeleken tussen studies. Vitale kleurstoffen kunnen ook C. elegans EV’s labelen, maar ze zijn niet zo helder als EV’s gelabeld met Di-8-ANEPPS.
Deze zuiveringsaanpak speelt in op de actieve afscheiding van EV’s buiten het lichaam van intacte, levende wormen. Hierdoor kunnen C. elegans EV’s worden geïsoleerd bij vergelijkbare zuiverheid en overvloed als uit celcultuur, specificaties die voldoende zijn voor het identificeren van honderden eiwit- en RNA-ladingen via LC-MS-MS en RNAseq-analyse26. Zo kan de grote bibliotheek van reagentia beschikbaar voor C. elegans onderzoek worden benut voor het onderzoeken van de invloed van de genetische en fysiologische verstoring op EV lading samenstelling.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen Nick Terzopoulos dankbaar voor wormplaten en reagentia; het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) van het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) voor de N2 nematodelijn; Lucia Vojtech, PhD, voor hulp bij de nanodeeltjes tracking analyse; Jessica Young, PhD, en Marie Claire, MD, PhD, voor hiPSC-afgeleide neuronale geconditioneerde celmedia; Wai Pang voor hulp met TEM beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door NIH grant P30AG013280 aan MK en NIH grant AG054098 aan JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |