Разделение конверта клетки для Грам-отрицательных бактерий в Внутренние и Внешние фракции Membrane с Технически регулировками для Acinetobacter baumannii

Грамотрицательные бактерии производят две мембраны, которые разделены периплазмическим пространством и пептидогликанской клеточной стенкой^1. Внутренняя мембрана (IM) заключает цитозол и является симметричным двухслойным фосфолипидами. Пептидогликан защищает от тургорского давления и обеспечивает бактерию клеточной формой, а также крепится к внешней мембране (ОМ) липопротеинами^2,,3. ОМ окружает периплазм и преимущественно асимметрично. Внутренняя листовка состоит из фосфолипидов и внешняя листовка состоит из гликолипидов, известных как липулигосахариды (LOS) или липополисахариды (LPS)^4,5. Липидная асимметрия и биохимия молекул LOS/LPS во внешней листовке придают барьерные свойства поверхности клетки, которые защищают бактерию от опасностей в ее окружающей среде^6,,7.

Молекулы LPS состоят из трех составляющих: липидный дизакчаролип, ядро олигосахарида и О-полисахарид или O-антиген. Липид А является умножить acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharides состоят из 10-15 сахаров, известных как грубые LPS или R-LPS. Ядро подразделяется на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D-манно-восьмилозоновой кислоты (кдо) и одного или нескольких остатков гептоза, а также внешней области, которая состоит, как правило, из гексосов (глюкоза или галактоза) и гептозов, или ацетамамидо сахара⁵. Область внешнего ядра более изменчива по своим компонентам и структуре, чем внутреннее ядро. В Salmonella spp., только одна основная структура была описана; однако, в Escherichia coli есть пять различных основных структур (обозначенных K-12, R1, R2, R3 и R4)⁸. E. coli K-12 DH5, который мы используем в этой процедуре несет мутации, что приводит к производству R-LPS⁹. Молекулы R-LPS не имеют O-антигена moiety и имеют аналогичный молекулярный вес молекул LOS.

Добавление O-антигена к R-LPS превращает эту молекулу в гладкую LPS, или S-LPS. O-антигены построены из коротких 3-4 углеводных субъединиц и состоят из нескольких методов с различной длиной цепи¹⁰. Некоторые LPS-производящих бактерий, как Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium), дисплей тримодального распределения молекул LPS на их поверхности^10,11. Очень длинная цепь O-антигенов может содержать более ста субъединиц и весить более ста килодальтонов. O-антигены обеспечивают поверхностные свойства бактерии, которые необходимы, чтобы противостоять антибиотикам, уклоняться от хипризавания бактериофагами, и вызывать болезни.

Виды Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria и другие генерируют молекулы ЛОС вместо молекул LPS на их поверхности¹². Молекулы LOS состоят из липидов А и ядра олигосахаридов, но не хватает O-антигена. Эти типы грамотрицательных бактерий модифицировать их основные олигосахариды с дополнительными сахарами и комбинациями сахаров, чтобы изменить свойства поверхности¹². Как LOS, так и LPS-производящие микробы произвностируют фосфаты на липидных и основных молекулах с катионными муатиами⁷. Эти дополнения включают фосфоэтаноламин, галактозамин и аминоарабиноззамены, которые функционируют путем нейтрализации анионического поверхностного заряда и тем самым защиты от катионных антимикробных пептидов. Грамотрицательные бактерии также изменить структуру ядра олигосахарида с переменной не-stoichiometric замены сахара, или дополнительные молекулы кдо, и изменить количество ацил цепи на липид-A disaccharolipids⁷.

Способность изолировать чат от ОМ Грам-отрицательных бактерий сыграла важную роль для понимания роли клеточной оболочки в устойчивости к противомикробным препаратам и патогенеза^{болезни 11,12}. Выводы этого подхода были использованы для вывода механизмов сборки, обслуживания и реконструкции белка, фосфолипида и гликолипидов для ОМ.

Наша лаборатория регулярно выполняет бактериальные липидомные анализы для изучения белково-опосредованной липидной регуляции и липидной функции в различных грамотрицательных видов. Объемы, используемые в протоколе, отражают рутинное использование этой процедуры для анализа нерадиомаркированных фосфолипидов тонким слоем хроматографии и жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии^13,14.

Протокол начинается с разоблачения охлажденной подвески грамотрицательных бактерий к высокому осмолялярному раствору сахарозы и добавлению лизозима, чтобы отделить ОМ от основного пептидогликанского слоя (Рисунок 1)¹². EDTA затем добавляется для облегчения проникновения лизозима, так как распущенный секвестр катионов нарушает боковое электростатическое взаимодействие между соседними молекулами LOS/LPS^15. Первоначальный протокол, из которого был адаптирован наш, требовал образования сферопластов, грамотрицательных бактериальных клеток, которые состоят из плазменной мембраны и цитозола, но не имеют пептидогликанского слоя и ОМ. Не исключено, что сферопласты производятся адаптированным методом; однако, техника не полагается или предназначаю на их образовании для успеха. Вместо этого, лизозим-EDTA обработанные бактерии быстро собирают центрифугирование и повторно подвешены в сахарозный раствор меньшей концентрации перед давлением лизиса. OMs, которые могли бы быть освобождены путем формирования сферопластов, теоретически должны быть собраны из супернатантов обработанных клеток, но этот подход не подробно описан в настоящем. В конечном счете, обработанные клетки подвергаются обычной гомогенизации и лизис, что повышает эффективность и воспроизводимость процедуры разделения мембраны^16.

После лизиса, общая мембраны собираются ультрацентрифугации и применяется к прерывистой сахарозы градиент плотности для фракции IM и Омс. Классический подход использует более непрерывный градиент, который состоит по крайней мере из пяти различных решений сахарозы^11,12. Прерывистый градиент в нашем протоколе состоит из трех сахарозных растворов и разделов двухслойных на две отдельные фракции¹⁷. Молекулы LOS и LPS в пределах OMs Грам-отрицательных бактерий диск конверт для раздела в верхней коричневой низкой плотности IM фракции и нижней белой высокой плотности OM фракции(Рисунок 1 и рисунок 2).

Acinetobacter baumannii являются важными мультирезистентными человеческими патогенами, которые производят молекулы LOS в их ОМ и возводят клеточную оболочку, которую трудно отделить^18,,19. Последние работы показывают, что производные протокола мы представляем здесь могут быть использованы для раздела двухслойных этих организмов²⁰. Поэтому мы протестировали наш протокол на A. baumannii 17978. Первоначально эта процедура была неадекватной. Тем не менее, мы изменили концентрацию сахарозы раствора средней плотности и значительно улучшили разделение(рисунок 2). Тест NADH дегидрогеназы и LOS / LPS добычи и обнаружения процедура была использована для подтверждения разделения для A. baumannii, дикий тип S. Тифимурий и два O-антигена дефицитных энтеробактериальных генотипов; а именно, galE-мутант S. Тифимурий и лабораторный штамм, E. coli DH5 “(рисунок 3 и рисунок 4).

Цель этой работы заключается в обеспечении рационализированный подход для воспроизводимой изоляции мембран грамотрицательных бактерий. Протокол может быть использован для изучения многих типов мембранных молекул для этих микробов.