Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries Gram-négatives dans les fractions de membrane intérieure et extérieure avec des ajustements techniques pour Acinetobacter baumannii

Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes qui sont séparées par un espace périplasmique et une paroi de cellules peptidoglycanes¹. La membrane interne (IM) enveloppe le cytosol et est un bilayer symétrique de phospholipides. Peptidoglycan protège contre la pression turgor et fournit la bactérie avec une forme cellulaire, et est attaché à la membrane externe (OM) par les lipoprotéines^2,3. L’OM entoure le périplasme et est principalement asymétrique. Le dépliant intérieur se compose de phospholipides et le dépliant externe se compose de glycolipids connus sous le nom lipooligosaccharides (LOS) ou lipopolysaccharides (LPS)^4,5. L’asymétrie lipidique et la biochimie des molécules LOS/LPS dans le dépliant externe confèrent des propriétés de barrière à la surface cellulaire qui protègent la bactérie contre les dangers dans son environnement^6,7.

Les molécules de LPS sont composées de trois constituants : le lipide A disaccharolipid, l’oligosaccharide de noyau, et l’O-polysaccharide ou O-antigène. Lipid A est une dispersion acylée. Les core-oligosaccharides sont composés de 10 à 15 sucres connus sous le nom de LPS brut ou R-LPS. Le noyau est subdivisé dans la région intérieure, composé de 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonique acide (kdo) et un ou plusieurs résidus d’heptose, et une région extérieure qui se compose généralement d’hexoses (glucose ou galactose) et heptoses, ou sucres d’acétalo⁵. La région du noyau extérieur est plus variable dans ses composants et sa structure que le noyau intérieur. Dans Salmonella spp., une seule structure centrale a été décrite; cependant, à Escherichia coli il existe cinq structures de base différentes (désignées K-12, R1, R2, R3 et R4)⁸. E. coli K-12 DH5, que nous utilisons dans cette procédure porte une mutation qui se traduit par la production R-LPS⁹. Les molécules R-LPS n’ont pas la moiety O-antigène et ont un poids moléculaire similaire aux molécules de LOS.

L’ajout d’O-antigène à R-LPS transforme cette molécule en LPS lisse, ou S-LPS. Les O-antigènes sont construits à partir de sous-unités courtes de 3-4 hydrates de carbone et se composent de multiples modalités avec des longueurs de chaîne variables¹⁰. Certaines bactéries productrices de LPS, comme Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), afficher une distribution trimodale de molécules LPS sur leur surface^10,11. La chaîne très longue O-antigènes peut contenir plus d’une centaine de sous-unités et peser plus d’une centaine de kilodaltons. Les O-antigènes fournissent des propriétés de surface à la bactérie qui sont nécessaires pour résister aux antibiotiques, échapper à la prédation par bactériophages, et causer des maladies.

Espèces de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria et d’autres génèrent des molécules los LOS au lieu de molécules LPS sur leur surface¹². Les molécules de LOS se composent des lipides A et des oligosaccharides de noyau mais n’ont pas l’O-antigène. Ces types de bactéries Gram-négatives modifient leurs oligosaccharides de base avec des sucres supplémentaires et des combinaisons de sucres pour modifier les propriétés de surface¹². Les microbes DE LOS et de LPS-producteurs dérivatisent les phosphates sur les molécules de lipide A et de noyau avec des moieties cationiques⁷. Ces ajouts incluent la phosphoethanolamine, la galactosamine et les substitutions d’aminoarabinose, qui fonctionnent en neutralisant la charge de surface anionique et protégeant ainsi contre les peptides antimicrobiens cationiques. Les bactéries gram-négatives modifient également la structure d’oligosaccharide de noyau avec des substitutions non-stoichiométriques variables des sucres, ou molécules de kdo supplémentaires, et modifient le nombre de chaînes d’acyl sur les désaccharolipids lipidiques-A⁷.

La capacité d’isoler la GI de l’OM des bactéries Gram-négatives a été déterminante pour comprendre le rôle de l’enveloppe cellulaire dans la résistance aux antimicrobiens et la pathogénie des maladies^11,12. Les dérivations de cette approche ont été utilisées pour déduire les mécanismes d’assemblage, d’entretien et de remodelage des constituants de protéines, de phospholipides et de glycolipid pour l’OM.

Notre laboratoire effectue régulièrement des analyses lipidiques bactériennes pour étudier la régulation lipidique et la fonction lipidique à médiation protéique chez une variété d’espèces Gram-négatives. Les volumes utilisés dans le protocole reflètent l’utilisation systématique de cette procédure pour analyser les phospholipides non radiolacés par la chromatographie à couches minces et la spectrométrie de masse tandem de chromatographie liquide^13,14.

Le protocole commence par exposer une suspension réfrigérée des bactéries Gram-négatives à une solution osmolar élevée de saccharose et en ajoutant du lysozyme pour dissocier l’OM de la couche peptidoglycane sous-jacente(figure 1)¹². EDTA est ensuite ajouté pour faciliter la pénétration du lysozyme, puisque la séquestration de cation divalente perturbe les interactions latérales de pontage électrostatique entre les molécules adjacentes DE/LPS¹⁵. Le protocole original à partir duquel le nôtre a été adapté a nécessité la formation de sphéoplastes, une forme de cellules bactériennes Gram-négative qui se composent d’une membrane plasmatique et d’un cytosol, mais qui n’a pas la couche peptidoglycan et un OM. Il est possible que les sphéoplastes soient produites par la méthode adaptée ; cependant, la technique ne repose pas ou n’a pas l’intention de leur formation pour le succès. Au lieu de cela, les bactéries traitées à la lysozyme-EDTA sont rapidement récoltées par centrifugation et réendées dans une solution saccharose de moindre concentration avant une lyse pressurisée. Les OM qui auraient pu être libérés en formant des sphéroplastes devraient en théorie être récoltables des supernatants des cellules traitées, mais cette approche n’est pas détaillée dans les présentes. En fin de compte, les cellules traitées sont soumises à l’homogénéisation conventionnelle et la lyse, ce qui améliore l’efficacité et la reproductibilité de la procédure de séparation de la membrane¹⁶.

Après la lyse, les membranes totales sont collectées par ultracentrifugation et appliquées à un gradient discontinu de densité de saccharose pour fractionner les IM et les OM. L’approche classique utilise un gradient plus continu qui se compose d’au moins cinq solutions de saccharose différentes^11,12. Le gradient discontinu dans notre protocole se compose de trois solutions de saccharose et divise les bilayers en deux fractions distinctes¹⁷. Les molécules DE et LPS dans les OM des bactéries Gram-négatives conduisent l’enveloppe à se cloisonner en une fraction de QNI brune supérieure de basse densité et une fraction blanche inférieure d’OM à haute densité(figure 1 et figure 2).

Acinetobacter baumannii sont d’importants agents pathogènes humains multirésistants qui produisent des molécules de LOS dans leur OM et érigent une enveloppe cellulaire qui est difficile à séparer^18,19. Des travaux récents suggèrent qu’une dérivation du protocole que nous présentons ici peut être utilisée pour diviser les bilayers de ces organismes²⁰. Par conséquent, nous avons testé notre protocole sur A. baumannii 17978. Au départ, la procédure était inadéquate. Cependant, nous avons modifié la concentration de saccharose de la solution de densité moyenne et la séparation grandement améliorée(figure 2). Un essai de déshydrogénase NADH et une procédure d’extraction et de détection DE LOS/LPS ont été utilisés pour confirmer la séparation pour A. baumannii, de type sauvage S. Typhimurium et deux génotypes entérobactériens déficients en oegène; à savoir, galE-mutant S. Typhimurium et une souche de laboratoire, E. coli DH5MD(figure 3 et figure 4).

L’objectif de ce travail est de fournir une approche rationalisée pour isoler de façon reproductrice les membranes des bactéries Gram-négatives. Le protocole peut être utilisé pour étudier de nombreux types de molécules associées à la membrane pour ces microbes.