このプロトコルは、30日間培養したマウス後期胎児腸オルガノイドを用いて、インビトロで吸引から離乳移行を模倣する方法を記述する。
吸引期間の終わりに、多くの哺乳類種は、固形食品を消化する能力に関連する腸上皮に大きな変化を受ける。このプロセスは、吸引から遠性への移行と呼び、代謝および形態学的調整と手をつないで行く成人上皮と新生児上皮の置換をもたらす。これらの複雑な発達変化は、腸上皮細胞に内在する遺伝的プログラムの結果であるが、ある程度は外因性因子によって変調することができる。胎児期後期からのマウス原発性腸上皮細胞の長期培養は、インビトロで吸引から離離性の移行を再現する。ここでは、このプロセスをインビトロでモデル化するのに最も適したマウス胎児腸オルガノイド培養のための詳細なプロトコルについて説明する。我々は、時間の経過に伴う吸引から離れへの移行に関連する腸機能の変化を監視するために設計されたいくつかの有用なアッセイを説明する。さらに、インビトロで吸引から遠性への移行のタイミングを変調する表現として、生体内での吸引から二性移行に影響を与えることができる外因性因子の例を含む。このインビトロアプローチは、吸引から遠回しへの移行の分子機構と、このプロセスのモジュレーターを研究するために使用することができる。重要なことに、研究における動物倫理に関しては、このインビトロモデルによってin vivoモデルを置き換えることは、動物実験の精製に寄与し、場合によっては腸の成熟過程を研究するための動物の使用の減少に寄与する。
マウスや男性を含む多くの哺乳類種では、新生児腸には完全に成熟した腸上皮とは異なるいくつかの特徴がある。これらの特徴は主要な炭水化物として高脂肪および低炭水化物を含むミルクを消化し、吸収する新生児の腸細胞を促進する。新生児腸上皮細胞のブラシ境界は、ジサカリダーゼ・ラクタゼ・フロリジンヒドロラーゼ(Lct)1を発現し、乳二糖乳糖を消化する。吸引期間の後、腸細胞は複雑な炭水化物が豊富で脂肪分が少ない固形食品を消化するために適応します。これは、ラクターゼからスクラーゼイソマルターゼ(シス)およびトレハラーゼ(Treh)へのブラシボーダージサカリダーゼ発現のスイッチによって現れ、固形食品2に存在するより複雑な炭水化物を消化することができる。別の代謝スイッチは、牛乳中のアルギニンの低濃度に関連しています。.アルギニンの必要性を提供するために、新生児腸細胞は、アルギニン生合成における速度制限酵素を発現し、アルギニノコク酸シンターゼ-1(Ass1)、アルギニン3を合成する。対照的に、成体腸細胞はアルギニン2(Arg2)を発現し、固形食品に豊富なアルギニンを異化することができる酵素である。さらに、新生児腸上皮は、乳から循環/血流4への母体IgGの吸収を媒行する免疫グロブリン(FcRn)に対する新生児Fc受容体を発現する。FcRnの発現は、吸引から遠散への移行5の間に著しく低下する。マウスにおいて、パネス細胞の成熟は出生後に起こり、クリプトの形成および成熟と一致し、そしてリソソーム(Lyz)およびデフェンシン6の抗菌ペプチドの発現によって特徴付けられる。
これらの変化はすべて、吸引から遠乳への移行の一部であり、腸上皮が成熟成人状態に達したときに、生後1ヶ月から1ヶ月の年齢まで徐々に起こるプロセスである。吸引から遠性への移行は、本質的に調節され、腸管に発達的に設定されます。転写因子Bリンパ球誘発成熟タンパク質-1(Blimp-1)は、この本質的成熟プロセス7において重要な役割を果たす。Blimp-1は新生児上皮で高度に発現し、その発現は減少し、吸引から遠乳への移行中に失われるため、新生児腸上皮の信頼できるマーカーとして機能することができます。本質的なプロセスであるにもかかわらず、吸引から遠性への遷移は、外部要因によって変調することができます。例えば、コルチゾールの合成類似体は、デキサメタゾン、生体内8、9における腸の成熟を促進することが知られている。
吸引から切断への移行を含む腸の上皮成熟を研究するために使用される現在のインビトロモデルは、成人腸上皮の特徴を担う成人上皮細胞株および/または成人オルガノイドを利用する。我々は最近、後期胎児腸から単離された原発性腸上皮細胞が成熟し、オルガノイド10としてインビトロ成長した場合の吸引から離乳移行を再現することを実証した。さらに、この腸の成熟過程がインビボと同じペースで起こることを示した。最後に、デキサメタゾンを使用して、生体内研究で説明したのと同じ方法で成熟プロセスを加速しました。
ここでは、マウス後期胎児腸オルガノイドの単離および培養のための正確なプロトコルを概説する。長期にわたるオルガノイド培養のためのサンプルを収集する好ましい方法と、インビトロで吸引から遠乳への移行を監視する方法について説明する。このプロトコルは、このプロセスの腸上皮成熟および変調器のインビトロ研究に使用することができ、より高いスループット、データの品質と翻訳値の増加、および動物の使用の減少をもたらす。
このプロトコルは、インビトロで吸引から二乳転移を模倣するために長時間にわたって後期胎児腸オルガノイドの培養を記述する。成熟のプロセスは、生体内のペースに等しく、培養の1ヶ月後に完了します。定量RNAおよびタンパク質技術を用いたこの培養物の下流分析が詳細である。
このプロトコルでは、E18-E20マウス胚由来の一次腸細胞が使用される。このプロトコルのオルガノイドを生成するために使用される一次マウス細胞の発達段階は特に重要である。以前の発達段階を使用すると、成人オルガノイド15、16への限定的な移行を伴う長期間にわたって特定の胎児遺伝子発現を維持する腸スフェロイドの生成をもたらす。唯一の後期胎児期回転楕円体は、インビトロ10で成人オルガノイドにトランジットすることができる。腸の成熟に対する外因性因子の影響に関して機会の窓を最大化するために、後期胎児期からの腸が推奨され、微生物や母乳にさらされた生まれた子犬からの腸ではない。特定の細菌代謝産物および乳成分が成熟プロセス17の修飾剤として作用することができると報告されている。
出生から成人までの全成熟を研究するために1ヶ月間培養を維持するのに十分な量の細胞を得るために、下流分析のためのサンプルを採取しながら、6〜8胚からの腸を出発原料として使用すべきである。培養物を生成するために同じ発達段階から胚を用いることが好ましい。発達段階のわずかな違いが成熟遺伝子の発現に影響を与える可能性があるので、異なるごみをプールすることはお勧めしません。
ここで説明するプロトコルは、腸の異なるセグメントの発達特徴を維持するために近位および遠位小腸からのオルガノイド生成を説明する。代わりに、腸全体を使用して、特定のマーカーの発現の増加/減少に関して全体的な成熟を調べることができる。後者の場合、培養を開始するために腸細胞を単離するために使用できる胚は少ない。
このプロトコルは、三次元オルガノイド培養を用いて開発される。オルガノイドは培養において動的な成長を受けるので、通過後の同時時点で下流分析のサンプルを収集することが重要です。このプロトコルでは、オルガノイドが堅牢な芽を含み、細胞死をほとんど含まない2つの分割間の中程度の時間を表すので、通過後3日目を選択しました。通過後の別の時間ポイントを使用できますが、実験全体で一貫性を保つ必要があります。オルガノイド内腔の死細胞の増加が結果に影響を与える可能性があるので、通過後7日間以上オルガノイドを増殖させないことをお勧めします。
我々の実験では、デキサメタゾンを例として、生体内9、18で腸の成熟を加速するために文献で示され、最もよく研究されている外因性因子の例として使用した。デキサメタゾンは、ゲノム経路と非ゲノム経路の両方を介してその効果を発揮します。例えば、ゲノム調節のレベルでは、Sis mRNAレベルの早熟な増加が観察され得る。非ゲノムレベルでは、トレハラーゼなどの消化酵素の活性の変化を観察します。いずれも、生体内19で観察される腸ブラシ境界酵素に対するスクラーゼ遺伝子活性化および非ゲノム活性化作用に関するデキサメタゾンの具体的な態様に従う。合成グルココルチコイドのような外因性因子が、オルガノイド培養における吸引から離乳移行の特定の態様を調節することができるという事実は、生体内で説明されるものと同様に、腸体の成熟の異なる種類の調節剤の調査のためのモデルとしてマウス胎児腸オルガノイドをさらに確立する。
ヒト腸上皮の形態学的成熟は22週の妊娠段階で子宮内で完了するが、腸の関門機能は摂食の種類と密接な関係で小児期まで成熟し、微生物叢および免疫応答。これらの発達段階でのヒト組織の利用可能性が限られているため、in vitroマウスモデルの翻訳値は、腸の成熟を調節することができる因子の高スループットスクリーンの可能性にあり、中から保存されるプロセス哺乳類を吸う。
重要なことに、研究における動物倫理に関して、このモデルは動物に対して行われる介入を含まないので、動物実験の精製に寄与することができる。研究の質問を1つまたは2つの文化のポイントに再設計することで、動物の数をさらに減らすことができます。
The authors have nothing to disclose.
なし。
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |