פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקות מעבר היניקה-to-הגמילה בתוך מבחנה באמצעות העכבר מאוחר מעיים של המעי העוברי תרבותי במשך 30 ימים.
בסוף תקופת היניקה, מינים רבים של יונקים עוברים שינויים משמעותיים באפיתל המעי הקשורים ליכולת לעכל מזון מוצק. תהליך זה נקרא מעבר יניקה-to-הגמילה ותוצאות החלפת אפיתל ה, עם האפיתל המבוגר אשר הולך יד ביד עם התאמות מטבולית מורפולוגית. אלה שינויים התפתחותיים מורכבים הם תוצאה של תוכנית גנטית כי הוא מהותי בתאי אפיתל המעי אבל יכול, במידה מסוימת, להיות מאופנן על ידי גורמים חיצוניים. תרבות ממושכת של העכבר תאים אפיתל המעי העיקרי מהתקופה העוברית המאוחרת, לאחר מעבר היניקה-הגמילה בתוך מבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור תרבות העוברי העכבר מעיים אורגאיד המתאים ביותר למודל זה תהליך בתוך מבחנה. אנו מתארים מספר שימושי שנועד לפקח על שינוי של פונקציות המעי הקשורות מעבר היניקה-אל-הגמילה לאורך זמן. בנוסף, אנו כוללים דוגמה של גורם חיצוני שמסוגל להשפיע על מעבר היניקה-אל-הגמילה ב-vivo, כייצוג של מודלדירוג העיתוי של המעבר מתוך הגמילה במבחנה. זה בגישה מחוץ למבחנה ניתן להשתמש כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים של מעבר היניקה-לגמילה, כמו גם מאפטורים של תהליך זה. חשוב מכך, ביחס לאתיקה בעלי חיים במחקר, החלפת מודלים in vivo על ידי זה במודל מתורבת תורמת עידון של ניסויים בעלי חיים ואולי ירידה בשימוש בבעלי חיים כדי ללמוד תהליכי ההבשלה של המעיים.
במינים רבים של יונקים, כולל עכברים וגברים, המעי ה, יש מספר תכונות שונות מן האפיתל המעי המלא בוגרת. תכונות אלה להקל על הנוציטים לעיכול לעכל ולספוג חלב, אשר מכיל גבוה שומן ופחמימות נמוכות, עם לקטוז כמו פחמימות גדולות. גבול המברשת של התאים האפיתל המעי הנועיים לבטא את הפירוק לקטאז-phlorizin הידרולז (lct)1 כדי לעכל את החלב דו-סוכר לקטוז. לאחר תקופת היניקה, הסתגלות הגוף לעכל מזון מוצק, כי הוא עשיר בפחמימות מורכבות נמוך בשומן. זה בא לידי ביטוי באמצעות מעבר של גבול המברשת disaccharidase הביטוי מן לקטאז ל sucrase-איזואלבורסה (Sis) ו trehalase (Treh), אשר יכול לעכל פחמימות מורכבות יותר נוכח מזון מוצק2. מתג מטבולית נוסף קשור לריכוז הנמוך של ארגינין בחלב. כדי לספק את הצורך של ארגינין, הנוציטים באנתאי לבטא את הקצב הגבלת האנזים בביוסינתזה של ארגינין, הארגינוסות1 סטנדרטים -1 (Ass1), כדי לסנתז את ארגינין3. לעומת זאת, מבוגר בידור מהיר arginase 2 (Arg2), אנזים המסוגל לבטל את arginase כי הוא שופע מזון מוצק. יתר על כן, האפיתל המעי הלופנום מבטא את הקולטן של הלוגלוטים עבור החיסוני (FcRn), אשר מדיה הקליטה של IgG אימהי מן החלב לתוך זרימת הדם/מחזור הדם4. הביטוי של FcRn מסרב באופן משמעותי במהלך מעבר היניקה-לגמילה5. בעכברים, התבגרות של תאים paneth מתרחשת postnatally, בד בבד עם היווצרות והתבגרות של קריפטים, והוא מאופיין על ידי ביטוי של פפטידים מיקרוביאלית ליזוזום (lyz) ו השלכה חטאים6.
כל השינויים הללו הם חלק מהמעבר לגמילה, תהליך המתרחש בהדרגה לאחר הלידה לחודש אחד של גיל בעכברים, כאשר האפיתל המעי מגיע למצב מבוגרים בוגרת שלה. . מוסדר ומוכן לפיתוח בצינור הבטן גורם שעתוק B לימפוציטים המושרה חלבון-1 (בלון-1) ממלא תפקיד מפתח בתהליך זה התבגרות מהותי7. בלון בלון -1 מבוטא במידה רבה ב אפיתל התינוק, בעוד הביטוי שלה פוחתת והוא איבד במהלך המעבר היניקה-to-הגמילה ולכן יכול לשמש סמן אמין של אפיתל המעי ה, המיעיים. למרות היותו תהליך מהותי, מעבר היניקה-לגמילה יכול להיות מאופנן על ידי גורמים חיצוניים. לדוגמה, האנלוגי הסינתטי של הקורטיזול, דקאמתאסאחד, ידוע להאיץ בהבשלה של המעיים ב vivo8,9.
הנוכחי מודלים של חוץ גופית משמש לחקר התבגרות אפיתל המעי כולל מעבר היניקה-אל-והגמילה, לנצל קווי אפיתל למבוגרים תאים ו/או אורגנואידים למבוגרים אשר מאפיינים דוב של אפיתל המעי הבוגר. לאחרונה הדגמנו כי בתאי אפיתל המעי העיקרי בודד מן המעי עוברית מאוחר בוגרת לבין לכידה מעבר היניקה-אל-הגמילה כאשר גדל בחוץ גופית כמו אורגנואידים10. עוד הצגנו את העובדה שתהליך ההבשלה של המעיים במבחנה מתרחש באותו קצב כמו בvivo. לבסוף, השתמשנו דקסמטסון כדי להאיץ את תהליך ההבשלה באותה אופנה שתוארה במחקרים vivo .
כאן, אנו מתווה פרוטוקול מדויק לבידוד ולתרבות של העכבר המנוח אורגנואידים המעי. אנו מתארים את הדרך המועדפת של איסוף דגימות עבור תרבות ארגונית ממושכת ושיטות לפקח על מעבר היניקה-לגמילה בתוך מבחנה. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים בעלי מבחנה של התבגרות אפיתל מעיים ומודולטורים של תהליך זה ותוצאות תפוקה גבוהה יותר, הגדלת ערך האיכות והתמורה של הנתונים והפחתה של שימוש בבעלי חיים.
פרוטוקול זה מתאר culturing של אורגנואידים מאוחר מעיים עוברית למשך זמן ממושך לחקות מעבר היניקה-לגמילה בתוך מבחנה. תהליך ההבשלה שווה לקצב בvivo ומושלם לאחר חודש אחד בתרבות. ניתוח במטה של תרבות זו באמצעות RNA כמותי וטכניקות חלבונים מפורטים.
בפרוטוקול זה, תאי מעיים ראשוניים מעוברי E18-E20 העכבר משמשים. השלב ההתפתחותי של תאי עכבר ראשיים המשמשים להפקת אורגנואידים עבור פרוטוקול זה חשוב במיוחד. השימוש בשלב התפתחותי מוקדם יותר יגרום ליצירת מעיים המעיים השומרים על הביטוי הגנטי הספציפי שלהם במהלך תקופה ממושכת של זמן עם מעבר מוגבל לאורגנואידים למבוגרים15,16. רק מאוחר בשלב העוברי העובר מסוגלים לעבור לאורגנואידים למבוגרים ב מבחנה10. כדי למקסם את חלון ההזדמנויות ביחס להשפעה של גורמים חיצוניים על התבגרות הבטן, מעיים משלב עוברי מאוחר מומלץ ולא מעיים של גורים נולדו כי נחשפו חיידקים וחלב אמא. הוא דיווח כי מטבוליטים חיידקיים מסוימים ורכיבי חלב יכולים לשמש מכפילי התהליך ההבשלה17.
כדי להשיג כמויות מספיקות של תאים כדי לשמור על התרבות לחודש אחד כדי ללמוד את ההבשלה כולה מהלידה עד לבגרות, תוך איסוף דגימות עבור ניתוח במורד הזרם, מעיים של 6-8 עוברים צריך לשמש כחומר מתחיל. מעדיפים להשתמש בעוברים מאותו שלב התפתחותי ליצירת התרבות. אנו לא ממליצים על אגירת שינויים שונים כאשר הבדלים קלים בשלב ההתפתחותי יכולים להשפיע על ביטוי של הגנים הבגרותם.
הפרוטוקול המתואר כאן לחשבון הדור האורגואיד מהמעי הקטן והקצר ביותר כדי לשמור על תכונות התפתחותיות של מגזרים שונים של הבטן. כחלופה, המעי השלם יכול לשמש כדי לחקור התבגרות הכולל ביחס להגדיל/להקטין את הביטוי של סמנים ספציפיים. במקרה האחרון, ניתן להשתמש בפחות עוברים כדי לבודד תאי מעיים לצורך התחלת התרבות.
פרוטוקול זה מפותח באמצעות תרבויות תלת-ממדיות של אורגנואיד. כמו אורגנואידים לעבור צמיחה דינמית בתרבות, חשוב לאסוף דגימות עבור ניתוח במורד באותו זמן לאחר התהליך. בפרוטוקול זה, בחרנו את היום השלישי לאחר המעבר, כפי שהוא מייצג את הזמן הבינוני בין שתי הפיצולים שבו אורגנואידים מכילים ניצנים חזקים ומעט ללא מוות תאי. ניתן להשתמש בנקודת זמן חלופית לאחר הפסעה, אך היא צריכה להיות עקבית במהלך הניסוי כולו. אנחנו לא ממליצים אורגנואידים גדל במשך יותר מ -7 ימים לאחר מעבר, כמו גידול של תאי המוות בלומן אורגאיד יכול להשפיע על התוצאות.
בניסויים שלנו, השתמשנו דקסמטסון כדוגמה של גורם חיצוני המוצג הטוב ביותר ללמוד בספרות כדי להאיץ התבגרות מעיים ב vivo9,18. Dexamethasone מפעילה את השפעותיו באמצעות מסלולים גנומים ושאינם גנומים. לדוגמה, ברמה של תקנה גנומית, עלייה מלאה של רמות mrna של Sis ניתן לצפות. ברמה שאינה גנומית, אנו מתבוננים בשינויים בפעילות אנזימי העיכול כגון טרהלאז. שניהם מתוארים בהתאם להיבטים ספציפיים של דקסמטסון על sucrase גן הפעלה והפעלת לא גנומית השפעה על אנזימים מברשת המעי הנצפים ב vivo19. העובדה כי גורמים חיצוניים, כמו גלוקוקורטיקואידים סינתטי, יכול לווסת היבטים מסוימים של מעבר היניקה-אל-הגמילה בתרבות אורגאידית, בדומה לזה שמתואר vivo, עוד קובע את העכבר העוברי מעיים אורגנואידים כמודל לחקירה של סוג אחר של מאפטורים של התבגרות בטן.
למרות ההבשלה מורפולוגית של אפיתל המעי האנושי הושלמה ברחם בשלב הריונית של 22 שבועות, הפונקציה מחסום המעי מתבגר עד הילדות בקשר קרוב עם סוג של האכלה, פיתוח של microbiota ו תגובה חיסונית. בשל הזמינות המוגבלת של רקמות האדם בשלבים ההתפתחותיים הללו, ערך הטרנסלtional של מודל מבחנה מתורבת טמון באפשרות של מסכי תפוקה גבוהה של גורמים המסוגלים לעצב מעיים, תהליך שמור בקרב יונקים מוצצים.
חשוב מכך, ביחס לאתיקה בעלי חיים במחקר, מודל זה יכול לתרום לעידון של ניסויים בבעלי חיים כפי שאינו כולל התערבויות שבוצעו על בעלי חיים. מספר בעלי החיים ניתן לצמצם עוד יותר על-ידי עיצוב מחודש של שאלות מחקר לשתי נקודות זמן של תרבות שיאפשרו בדיקה של מספר מרכיבים בתרבות אחת.
The authors have nothing to disclose.
לא.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |