이 프로토콜은 30 일 동안 배양 된 마우스 후기 태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관 내에서 빨기 – 투 – 위닝 전이를 모방하는 방법을 설명합니다.
빨기 기간의 끝에서, 많은 포유류 종 고체 음식을 소화 하는 기능과 관련 된 장 상피에 큰 변화를 겪는다. 이 프로세스는 빨기-weaning 전환 이라고 하 고 신진 대사 및 형태 학적 조정과 함께 손에 가는 성인 상피와 신생아 상피의 대체 결과. 이 복잡한 발달 변경은 장 상피 세포에 내재되어 있는 유전 프로그램의 결과입니다 그러나, 어느 정도, 외인성 요인에 의해 조절될 수 있습니다. 늦은 태아 기간에서 마우스 1 차장 상피 세포의 장기간 배양, 시험관에서 빨기-weaning 전이 재범. 여기서, 우리는 시험관내에서 이 과정을 모델링하는 데 가장 적합한 마우스 태아 장 오르가노이드 배양에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 우리는 시간이 지남에 따라 빨아 – 이유 전이와 관련된 장 기능의 변화를 모니터링하도록 설계된 몇 가지 유용한 검사를 설명합니다. 추가적으로, 우리는 생체외에서 빨기-weaning 전환에 영향을 미칠 수 있는 외인성 요인의 예를 포함, 시험관에서 빨기-weaning 전환의 타이밍을 변조의 표현으로. 이 시험관 내 접근법은 이 프로세스의 변조기뿐만 아니라 새끼-수유 전이의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 중요한 것은, 연구에서 동물 윤리에 관하여, 이 시험관 내 모형에 의하여 in vivo 모형을 대체하는 것은 동물 실험의 정제에 기여하고 창자 성숙 과정을 공부하기 위하여 동물의 사용에 있는 감소에 가능하게.
마우스와 남자를 포함하여 많은 포유류 종에서, 신생아 장은 완전히 성숙한 장 상피에서 구별되는 몇몇 특징이 있습니다. 이러한 특징은 유당을 주요 탄수화물로 함유한 고지방 및 저탄수화물을 함유한 우유를 소화하고 흡수하는 신생아 장세포를 용이하게 합니다. 신생아장상피세포의 브러쉬 테두리는 이삭카리다제 락타제-플로리진 하이드로라제(Lct)를 발현하여 우유 이당류 유당을 소화한다. 빨기 기간 후에, enterocytes는 복잡한 탄수화물이 풍부하고 지방이 낮은 단단한 음식을 소화하기 위하여 적응합니다. 이는 락타아제에서 수크라제 이소말타제(Sis) 및 트레할라제(Treh)로의 브러시 테두리 이색리다아제 의 스위치에 의해 나타나며, 이는 고체 식품에 존재하는 더 복잡한 탄수화물을 소화할 수 있다2. 또 다른 신진 대사 스위치는 우유에 있는 아르기닌의 낮은 농도 관련. 아르기닌에 대한 필요성을 제공하기 위해, 신생아 장세포는 아르기닌 생합성에서 효소를 제한하는 속도를 발현, 아르기노세포신타제-1(Ass1), 아르기닌3를합성한다. 대조적으로, 성인 장세포는 아르기나제 2(Arg2)를 발현하며, 고형 식품에 풍부한 아르기닌을 이화시킬 수 있는 효소이다. 또한, 신생아 장 상피는 면역 글로불린 (FcRn)에 대한 신생아 Fc 수용체를 표현하며, 이는 우유에서 산모 IgG의 흡수를 순환 / 혈류로 중재합니다4. FcRn의 발현은 빨기에서 위닝 전환5동안 크게 감소합니다. 마우스에서, Paneth 세포의 성숙은 토굴의 형성 및 성숙과 우연히 발생하며, 항균 펩티드 리소좀 (Lyz) 및 디펜신6의발현을 특징으로한다.
이 모든 변경은 창자 상피가 성숙한 성인 상태에 도달할 때 마우스에 있는 나이의 1 달에 출생 후에 점차적으로 생기는 프로세스, 빨기-weaning 전환의 일부입니다. 빨기-위닝 전환은 본질적으로 조절되고 장 관에서 발달적으로 설정됩니다. 전사 인자 B 림프구 유도 성숙 단백질-1(Blimp-1)은 이러한 본질적인 성숙 과정7에서중요한 역할을 한다. Blimp-1은 신생아 상피에서 고도로 발현되며, 발현은 감소하고 새끼에서 위닝 전이 중에 손실되므로 신생아 장 상피의 신뢰할 수있는 마커역할을 할 수 있습니다. 본질적인 프로세스임에도 불구하고, 빨기에서 weaning 전환은 외부 요인에 의해 조절될 수 있습니다. 예를 들어, 코티솔, 덱사메타손의 합성 유사체는 생체 내 장 성숙을 가속화하는 것으로 알려져 있다8,9.
현재 시험관내 모델은 빨기-위닝 전이를 포함한 장 상피 성숙을 연구하고, 성인 상피 세포주 및/또는 성인 장 상피의 특성을 나타내는 성인 상피 세포주를 활용합니다. 우리는 최근에 1 차적인 장 상피 세포가 후반 태아 창자로부터 분리되어 유기체10으로시험관내에서 성장할 때 새끼-간 전이를 성숙하고 재입증한다는 것을 입증하였다. 우리는 또한 생체 외에서이 창 자 성숙 과정 생체 내에서 와 같은 속도로 발생 하는 것을 보여 주었다. 마지막으로, 우리는 생체 내 연구를 위해 설명된 것과 동일한 방식으로 성숙 과정을 가속화하기 위해 덱사메타손을 사용했습니다.
여기에서, 우리는 마우스 후기 태아 장 오르가노이드의 격리 그리고 문화를 위한 정확한 프로토콜을 개략적으로 설명합니다. 우리는 시험관에서 빨기-weaning 전환을 감시하는 장기간 오르가노이드 문화 및 방법을 위한 견본을 수집하는 바람직한 쪽을 기술합니다. 이 프로토콜은 이 프로세스의 장 상피 성숙 및 변조기의 시험관 내 연구에 사용될 수 있으며, 더 높은 처리량, 데이터의 품질 및 번역 값 증가 및 동물 사용의 감소를 초래합니다.
이 프로토콜은 시험관에서 빨기-weaning 전환을 모방하기 위하여 연장된 시간 동안 늦은 태아 창자 오르가노이드의 배양을 기술합니다. 성숙 과정은 생체 내 속도와 같으며 문화에서 한 달 후에 완료됩니다. 정량적 RNA 및 단백질 기술을 사용하여 이 배양의 하류 분석은 상세히 설명되어 있습니다.
이 프로토콜에서는 E18-E20 마우스 배아로부터의 1차 장 세포가 사용된다. 이 프로토콜에 대한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 1 차 마우스 세포의 발달 단계는 특히 중요합니다. 초기 발달 단계를 사용하면 성인 오르가노이드15,16으로의제한된 전이와 함께 장기간에 걸쳐 특정 태아 유전자 발현을 유지하는 장 스페로이드의 생성을 초래할 것이다. 만 늦은 태아 단계 스페로이드는 시험관 내 성인 오르가노이드로 통과 할 수있다10. 장 성숙에 외인성 요인의 영향에 관하여 기회의 창을 최대화하기 위하여는, 늦은 태아 단계에서 창자는 세균과 어머니 우유에 드러낸 태어난 새끼에게서 창이 아니라 추천됩니다. 특정 세균 대사 산물 및 우유 성분이 성숙 과정의 수정자 역할을 할 수있다고보고된다 17.
하류 분석을 위한 견본을 수집하는 동안, 출생에서 성년까지 전체 성숙을 공부하기 위하여 1 달 동안 배양을 유지하기 위하여 충분한 양의 세포를 장악하기 위하여는, 6-8 배아에서 내장은 시작 물자로 이용되어야 합니다. 배양을 생성하기 위한 동일한 발달 단계에서 배아를 사용하는 것이 바람직하다. 우리는 발달 단계에 있는 경미한 다름이 성숙 유전자의 표현에 영향을 미칠 수 있기 때문에 다른 쓰레기를 풀링하는 것을 추천하지 않습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 장의 다른 세그먼트의 발달 특징을 유지하기 위해 근위 및 말단 소장에서 오르가노이드 생성을 차지합니다. 대안으로, 전체 창 자 특정 마커의 증가/감소 발현에 대 한 전반적인 성숙을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 후자의 경우에, 더 적은 태아는 문화를 시작하기 위한 장 세포를 격리하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
이 프로토콜은 3차원 오르가노이드 배양을 사용하여 개발됩니다. 오르가노이드가 배양에서 역동적인 성장을 겪을 때, 통과 후 동시에 다운스트림 분석을 위한 샘플을 수집하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 유기노이드가 강력한 싹을 포함하고 거의 또는 전혀 세포 사멸을 포함하는 두 개의 분할 사이의 중간 시간을 나타내기 때문에, 통과 후 3 일을 선택했습니다. 패서드 후의 대체 타임포인트를 사용할 수 있지만 전체 실험 중에 일관성이 있어야 합니다. 우리는 유기체 루멘의 사망 세포의 증가가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 통로 후 7 일 이상 오르가노이드를 재배하지 않는 것이 좋습니다.
우리의 실험에서, 우리는 생체 내 성숙을 가속화하기 위해 문헌에서 가장 잘 연구되고 있는 외인성 인자의 예로 덱사메타손을 사용했습니다9,18. 덱사메타손은 게놈 경로와 비게놈 경로를 통해 그 효과를 발휘합니다. 예를 들어, 게놈 조절 수준에서, Sis mRNA 수준의 조숙한 증가가 관찰될 수 있다. 비 게놈 수준에서, 우리는 trehalase와 같은 소화 효소의 활동에 있는 변경을 관찰합니다. 둘 다 생체 내 에서 관찰되는 장내 브러쉬 경계 효소에 대한 수크라세 유전자 활성화 및 비게놈 활성화 효과에 대한 덱사메타손의 특이적 양상에 따라19. 합성 글루코코르티코이드와 같은 외인성 요인이 생체 내에서 설명된 것과 유사하게 오르가노이드 배양에서 젖을 짜는 전이의 특정 측면을 조절할 수 있다는 사실은 마우스 태아 장 내 오르가노이드를 장 성숙의 다른 종류의 변조기 조사를 위한 모델로 확립합니다.
인간의 장 상피의 형태학적 성숙은 22 주 임신 단계에서 자궁에서 완료되더라도, 장 장벽 기능은 먹이의 모형과 가까운 관계에서 유년기까지 성숙합니다, microbiota의 발달 및 면역 반응. 이러한 발달 단계에서 인간 조직의 제한된 가용성으로 인해, 시험관 내 뮤린 모델의 번역 값은 장 성숙을 조절 할 수있는 요인의 높은 처리량 스크린의 가능성에 있다, 프로세스 중 보존 포유류를 빨아.
중요한 것은, 연구에서 동물 윤리와 관련하여, 이 모델은 동물실험에 대한 개입을 포함하지 않기 때문에 동물 실험의 개선에 기여할 수 있다. 한 배양 내에서 여러 구성 요소를 테스트할 수 있는 하나 또는 두 개의 문화 적 시점으로 연구 질문을 재설계하여 동물의 수를 더 줄일 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
없음.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |