A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Wilber Sabiiti; Bariki Mtafya; Daniela  Alferes De Lima; Evelin Dombay; Vincent O. Baron; Khalide Azam; Katarina Oravcova; Derek  J. Sloan; Stephen  H. Gillespie

doi:10.3791/60460

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İmmünoloji ve Enfeksiyon

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Published: April 30, 2020

doi:

10.3791/60460

Wilber Sabiiti¹, Bariki Mtafya^1,2, Daniela Alferes De Lima¹, Evelin Dombay¹, Vincent O. Baron¹, Khalide Azam³, Katarina Oravcova⁴, Derek J. Sloan¹, Stephen H. Gillespie¹

¹Division of Infection and Global Health, School of Medicine,University of St Andrews, ²National Institute for Medical Research (NIMR)-Mbeya Medical Research Centre, ³Instituto Nacional de Saúde (INS), Ministério da Saúde, ⁴Institute of Biodiversity, Animal Health & Comparative Medicine, College of Medical, Veterinary & Life Sciences,University of Glasgow

Özet

Descriviamo un test di analisi del carico batterico molecolare della tubercolosi eseguito dopo l’inattivazione termica dell’espettorato. L’inattivazione del calore rende non infettivi i campioni di sputum e ovvia la necessità di laboratori di livello di contenimento 3 per i test molecolari della tubercolosi.

Abstract

La tubercolosi è causata dalla mitologia Mycobacterium (Mtb), un agente patogeno classificato dalle Nazioni Unite (ONU) come una sostanza biologica pericolosa di categoria B. Per motivi di sicurezza dei lavoratori, la movimentazione di tutti i campioni che si presume portino Mtb deve essere effettuata in un laboratorio a livello di contenimento (CL) 3. Il test TB Molecular bacterial load assay (TB-MBLA) è un test inverso di reazione a catena quantitativa polimerasi (RT-qPCR) che quantifica il carico battericolare Mtb utilizzando primer e sonde a doppia etichetta per 16S rRNA. Descriviamo l’uso dell’inattivazione termica per rendere i campioni di TB non infettivi preservando l’RNA per il TB-MBLA. Una aliquota di 1 mL del campione di espettorato in tubi di centrifuga da 15 mL ben chiusi viene bollita per 20 minuti a 80 , 85 o 95 gradi centigradi per inattivare i bacilli Mtb. La coltivazione del calore inattivato e il controllo (vivi) dei campioni per 42 giorni hanno confermato la morte della TB. Il campione inattivato viene quindi riempito con 100 l del controllo di estrazione e l’RNA viene estratto seguendo la procedura standard di isolamento dell’RNA. Non è stata osservata alcuna crescita nelle colture di campioni trattati con calore. L’RNA isolato è sottoposto a RT-qPCR in tempo reale, che amplifica un bersaglio specifico nel gene RRNA Mtb 16S, producendo risultati sotto forma di cicli di quantificazione (Cq). Una curva standard viene utilizzata per tradurre Cq in carico batterico, o unità formanti colonie stimate per mL (eCFU/mL). C’è una relazione inversa tra Cq e il carico batterico di un campione. La limitazione è che la disattivazione del calore lisce alcune cellule, esponendo l’RNA a RNaes che causano una perdita di <1 log₁₀eCFU/mL (vale a dire, <10 CFU/mL). Ulteriori studi determineranno la percentuale di pazienti a basso carico di lavoro che causano falsi risultati negativi a causa dell'inattivazione di calore.

Introduction

Causato da Mycobacterium tuberculosis (Mtb), oltre 7 x 10⁶ nuovi casi di tubercolosi (TB) sono segnalati a livello globale di cui oltre 1 x 10⁶ muoiono all’anno¹^,². Per invertire la tendenza, l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha lanciato un approccio a tre pilastri, tra cui lo sviluppo di efficaci strumenti diagnostici e terapeutici³. Classificata come una pericolosa sostanza biologica B dall’ONU, lavorare con campioni presunti positivi per Mtb richiede un livello di contenimento (CL) di 3. I laboratori CL3 sono costosi da costruire e mantenere. Di conseguenza, la maggior parte dei paesi dispone di servizi di cultura della TB centralizzati a livello regionale o nazionale. Ciò significa che la microscopia striscio è lo strumento diagnostico più disponibile nelle strutture sanitarie periferiche.

L’OMS ha approvato l’attuazione di test molecolari rapidi come Xpert MTB/RIF alle strutture sanitarie di livello 4, per lo più situate ai livelli distrettuali⁴^,⁵. Alcuni distretti sono piuttosto grandi e meno accessibili ad alcune persone. Pur è vantaggioso, Xpert MTB/RIF funziona rilevando il DNA Mtb. Il DNA è una molecola stabile che sopravvive a lungo dopo la morte delle cellule e quindi non è un buon standard per misurare le cellule vitali critiche per monitorare la risposta al trattamento⁵^,⁶. I saggi basati sull’RNA offrono un’alternativa per la misurazione accurata delle cellule vitali⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³. L’RNA esiste in diverse specie di stabilità variabile: RNA ribosomico (rRNA), RNA di trasferimento (tRNA) e RNA messaggero (mRNA). L’RNA messaggero è associato all’espressione genica e quindi il più strettamente associato all’attività cellulare e alla vitalità¹⁴. È importante notare che l’assenza di espressione genica non è equivalente alla morte cellulare perché patogeni come Mtb sono noti per esistere in stati inattivi (domeggiati) ma vitali¹⁵^,¹⁶. Le specie di RNA stabili come l’rRNA sono quindi marcatori migliori di stati attivi e inattivi di cellule vitali.

Utilizzando Escherichia coli, Sheridan ha mostrato che 16S rRNA proporzionalmente aumentato con la crescita batterica misurata da unità formanti colonia (CFU) conta¹⁷. C’è stato un calo simultaneo nei conteggi di CFU e 16S rRNA quando i batteri E. coli sono stati esposti agli antibiotici. Il calo dell’rRNA dopo la morte cellulare è stato un indicatore che potrebbe essere utilizzato come marcatore per la vitalità cellulare¹³^,¹⁷. Attingendo a questo principio, il test del carico batterico molecolare della TB (TB-MBLA) è stato sviluppato per prendere di mira M. tuberculosis 16S rRNA per misurare il carico batterico TB vitale come marcatore della risposta al trattamento per i pazienti con terapia anti-TB¹¹^,¹⁸^,¹⁹. Abbiamo ulteriormente sviluppato e ottimizzato il TB-MBLA per incorporare un controllo di estrazione cellulare che riflette la lisi di M. tuberculosis bacilli ed è robusto in diverse impostazioni ambientali²⁰. La procedura TB-MBLA richiede che i primi passi di isolamento dell’RNA da Mtb siano condotti in un laboratorio CL3 fino a quando le cellule Mtb non sono completamente lisminate per garantire la sicurezza dei lavoratori. Esso comprende anche la conservazione del campione per l’analisi retrospettiva in lotti a zero sotto la guanidina, una sostanza tossica di livello 4. A tal fine, abbiamo usato il calore per inattivare Mtb e rendere sicuri i campioni per TB-MBLA da eseguire nei laboratori a livello di microscopia spalmata.

L’uso del calore in laboratorio e applicazioni cliniche è stato intorno per secoli²¹^,²². Tuttavia, alcuni microrganismi come Mtb sono difficili da uccidere, e l’esposizione più breve al calore è insufficiente per uccidere tutte le cellule²³^,²⁴. Uno studio ha rivelato che il riscaldamento di 20 min di colture di TB a 80 gradi centigradi ha ucciso tutti i bacilli Mtb senza distruggere il DNA necessario per PCR²⁵. Successivamente, un certo numero di tecniche di estrazione del DNA di laboratorio attualmente riscaldano a 95 gradi centigradi. Abbiamo applicato lo stesso principio per dimostrare che l’ebollizione di campioni di TB a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi o 95 gradi centigradi inattiva Mtb preservando l’RNA sufficiente per la TB-MBLA da eseguire. La coltura inattivata o l’espettorato possono essere mantenuti in contenitori strettamente chiusi a temperatura ambiente o refrigerati per 7 giorni senza ridurre la quantità di rRNA quantificabile.

Il TB-MBLA, attualmente utilizzato come test di solo uso di ricerca (RUO) è adattabile ed è stato applicato a diversi tipi di campione tra cui espettorato, tessuto polmonare, e fluido spinale cerebrale. Deve ancora essere applicato sul liquido alveolar bronchiale, sangue, e altri tipi di campioni. Utilizzando l’espettorato come campione, i risultati della valutazione multisito in Africa (dati inediti) e le pubblicazioni precedenti¹⁸^,²⁶ mostrano che la sensibilità di MBLA è coerente con mycobacterium crescita indicatore di cultura del tubo (MGIT) coltura liquida. Tuttavia, TB-MBLA è più veloce, dando risultati in ore al contrario di giorni o settimane di cultura, specifici, non colpiti da microrganismi non TB nel campione, e dà una misura quantitativa della gravità della malattia. L’OMS ha recentemente riconosciuto TB-MBLA come candidato per sostituire la microscopia e la coltura dello striscio per il monitoraggio del trattamento della TB².

In questo articolo descriviamo in dettaglio l’inattivazione del calore e il protocollo TB-MBLA pubblicati in Sabiiti et al.²⁷. Questo protocollo dettagliato fornirà una risorsa visiva one-stop per gli utenti TB-MBLA in tutto il mondo.

Protocol

1. Preparazione del campione Cultura Lavorando su una panca pulita o in una cabina di classe 1, raccogli 1 mL di fase esponenziale la coltura Bacillus Calmette-Guérin (BCG) in tubi di centrifuga in plastica da 15 mL. Chiudere saldamente i tubi. NOT:</ Per elaborare un intero campione da 5 mL, sono necessari cinque tubi di centrifuga da 15 mL.AVVISO: È necessario un armadio di biosicurezza quando si lavora con qualsiasi coltura della TB. Campione di espettorato per il paziente Lavorando in uno spazio ben ventilato e indossando una maschera nasale, aprire con cura la tazza di campioni, pipette 1 mL aliquote in tubi di centrifuga di plastica da 15 ml e chiudere saldamente i tubi. NOT:</ Una punta larga della bocca è raccomandato per pipetta espettorato. Utilizzando un paio di forbici, tagliare la parte fine della bocca di punta 1 mL per creare una bocca più ampia. 2. Inattivazione termica Prima della preparazione del campione, impostare il bagno d’acqua a 95 gradi centigradi. NOT:</ La temperatura di 95 gradi aumenta la possibilità di ridurre l’attività di RNase e quindi preservare più RNA per la TB-MBLA a valle. Trasferire i tubi campione in un portapacchi immerso nel bagno d’acqua. Assicurarsi che tre quarti di ogni tubo campione sia immerso nell’acqua. Far bollire a 95 gradi centigradi per 20 min, quindi trasferire i tubi in panca per raffreddare a temperatura ambiente per 5 min prima di iniziare l’estrazione dell’RNA. NOT:</ L’inattivazione completa del calore di M. tuberculosis bacilli e BCG è stata verificata incubando campioni e controlli inattivati dal calore a 37 gradi centigradi per 42 giorni per verificare la crescita. Una misurazione ottica della densità a 600 nm (OD600) è stata effettuata al basale e quindi settimanale per il periodo di incubazione di 42 giorni. 3. Estrazione dell’RNA NOT:</ Il processo di estrazione dell’RNA qui descritto è per il kit di RNA elencato nella Tabella dei Materiali. Possono essere utilizzati altri kit di estrazione RNA adatti da diversi produttori. Aggiunta del controllo di estrazione (EC) Trasferire 1 mL di campioni inattivati a 1,5 mL. Spike 100 L della CE in ogni campione, chiudere il tubo e mescolare invertendo il tubo capovolto 3x. NOT:</ La CE è fornita con il kit di batteri vitali TB-MBLA (Tabella dei materiali). Sedimentazione cellulare Utilizzando una microcentrifuga da banco, centrifugare i tubi a 20.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Pipette al largo del supernatante, lasciando 50 litri di sedimenti. Sospendere il sedimento in 950 – L di lisitrico tampone pipetting su e giù, e trasferire l’intera sospensione nel tubo matrice lysing fornito con il kit di estrazione RNA (Tabella dei materiali). Assicurarsi che i tubi siano ben chiusi ed etichettare sia il coperchio che il lato del tubo. Per la lisi cellulare, trasferire i tubi dal passaggio 3.2.2 a un omogeneizzatore. Omogeneizzare i campioni per 40 s a 6.000 rpm. Purificazione dell’acido nucleico Centrifugare il lisato dal passo 3.3 a 12.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Preparare i tubi freschi da 1 mL e aggiungere 300 -L di cloroformio in ogni tubo. Utilizzando una punta da 1 mL con attenzione pipetta fuori dal supernatante senza toccare la matrice lising. Trasferire il supernatante al cloroformio contenente tubi e vortice per 5 s. Lasciare che il tubo si accerchi a 5 min o più fino a quando tre fasi (superiore, centrale e inferiore) sono chiaramente visibili. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Attentamente pipetta la fase superiore e trasferire in tubi freschi da 1,5 mL. Ai tubi al passo 3.4.5, aggiungere 500 L di etanolo a freddo ghiaccio 100%, chiudere i tubi e mescolare invertendo delicatamente a testa in giù 3x. Incubare i tubi a -80 gradi centigradi per 15 minuti o -20 gradi centigradi per 30 minuti e continuare l’estrazione, o lasciare a -20 gradi durante la notte per completare l’estrazione il giorno successivo. Impostare la microcentrifuga a 4 gradi centigradi e lasciare raffreddare ad almeno 12 gradi centigradi prima di iniziare la centrifugazione. Caricare i tubi nella microcentrifuga e centrifugare per 20 min a 13.000 x g. Scartare il supernatante, sostituire con il 70% di etanolo ghiacciato, e centrifugare per altri 10 min a 13.000 x g. NOT:</ Il 70% di etanolo deve essere fatto con acqua priva di nuclea sicca di grado molecolare. Scartare tutti i supernatali dal punto 3.4.7 e trasferire i tubi in un’incubatrice fissata a 50 gradi centigradi. Incubare per 20 min per asciugare il pellet RNA/DNA. Tenere i tubi parzialmente aperti per consentire l’evaporazione di tutto l’etanolo. Aggiungere 100 l di acqua priva di nucleata al pellet secco e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Vortice per 3 s per mescolare il contenuto. NOT:</ In questa fase l’estratto può essere conservato 2/3 giorni in frigorifero o più a -80 gradi centigradi fino a quando non viene eseguita la sezione 3.5. Rimozione del DNANOTA: Questo passaggio è fondamentale perché la presenza di DNA nell’estratto invalida il risultato dell’MBLA. Questa sezione si basa su un kit di rimozione del DNA (Tabella dei materiali). Preparare un mix dell’enzima DNase I 10x buffer e dell’enzima DNase I per il numero di campioni (10 dollari l of buffer e 1 l of DNase per campione) più il 10% in più per coprire qualsiasi perdita dal pipettaggio. Mescolare vortice e poi pipetta 11 – L in ogni tubo contenente l’estratto di RNA. Mescolare vortice vortice 3 s e poi girare brevemente (10 s a 13,000 x g) per rimuovere eventuali goccioline sulle pareti. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min nel blocco caldo o nell’incubatrice. Aggiungete un ulteriore 1 -L di Enzima DNase I direttamente in ogni tubo, mescolate bene vorticendoe e incubate per altri 30 min a 37 gradi centigradi. Scongelare il reagente di inattivazione DNase 10 min prima della fine dell’incubazione d’Annae. Vortex 20 s per garantire una sospensione omogenea e lattiginosa e quindi aggiungere 10 – L di reagente di inattivazione DNase in ogni estratto di RNA dal passo 3.5.2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min. Vortex 3x durante la fase di incubazione di 5 min. Centrifugare la miscela a 13.000 x g per 2 min. Trasferire con attenzione il supernatante a 1,5 mL RNase tubi liberi senza toccare alcuna della matrice di inattivazione. Conservare l’estratto di RNA in frigorifero se si esegue l’RT-qPCR nello stesso giorno o a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine. 4. Inverti Trascrizione qPCR Per campioni sconosciuti, diluire tutti gli estratti di RNA da utilizzare in un rapporto 1:10 in acqua libera di RNase. Mescolare bene vorticendo per 5 s e brevemente girare verso il basso per rimuovere eventuali goccioline o bolle d’aria. Per i campioni standard per una curva standard, prendere gli standard di RNA Mtb e EC dal congelatore -80 sC e scongelare a temperatura ambiente. Effettuare sette e sei diluizioni di campioni standard Mtb e EC rispettivamente. Cambiare le punte prima di trasferire la miscela da un tubo all’altro. NOT:</ I campioni standard vengono forniti con il kit TB-MBLA. Preparazione del mix masterNOTA: Master mix (MM) è una soluzione di reagenti PCR sufficiente ad amplificare tutti i campioni, gli standard e l’acqua per un controllo senza modello (NTC). L’acqua utilizzata come NTC deve essere la stessa acqua utilizzata nell’estrazione e per preparare la MM. Assicurarsi che gli standard, ogni campione di RNA e la sua diluizione decimale siano amplificati 2 volte per la reazione positiva della trascrizione inversa (RT) e 1x per la reazione negativa della trascrizione inversa (RT-). La reazione RT- è un controllo per determinare l’efficienza della rimozione del DNA(Tabella 1). Trasferire 16 – L di MM in ogni tubo di reazione PCR. Aggiungere 4 -L di estratto di RNA in ogni tubo di reazione RT e RT e acqua nei tubi di reazione NTC. Caricare i tubi di reazione in una macchina PCR in tempo reale e impostare le condizioni pcR come segue: 50 s per 30 min, 95 S per 15 min, 40x cicli a 94 s per 45 s, e 60 s per 1 min con acquisizione con fluorofori che assorbono in canali verdi e gialli. NOT:</ Il canale verde è il fluoroforo di rilevamento Mtb e il giallo è il fluoroforo di rilevamento dell’estrazione. Interpretazione dei risultatiNOTA: Assicurarsi che le reazioni duplicate dello stesso campione non differiscano da più di 1 deviazione standard. I valori Mtb ed EC Cq superiori a 30 sono considerati negativi. Vedere ulteriori dettagli sull’interpretazione nella tabella 2. Per interpretare la risposta al trattamento, convertire i valori Cq in carico batterico (eCFU/mL) utilizzando la curva standard. Leggere la risposta al trattamento come il cambiamento nel carico batterico durante il periodo di follow-up del trattamento. NOT:</ La diminuzione del carico batterico dopo il trattamento significa una risposta positiva (cioè farmaci anti-TB che uccidono i batteri della TB) mentre nessun cambiamento o aumento del carico batterico implica una risposta negativa, il che può significare resistenza dei batteri della TB ai farmaci anti-TB o il paziente che non aderisce in modo appropriato alla dose di trattamento. Il calo del carico batterico misurato da TB-MBLA è correlato all’aumento del tempo di MGIT alla positività della coltura (TTP). 5. Microscopia elettronica di trasmissione Trasferire 2 aliquote mL di colture e controlli inattivati dal calore in tubi di microcentrifuga da 2 mL. Centrifuga per 10 min a 20.000 x g. Scartare il supernatante e sospendere il pellet in 700 – L di buffer di fissaggio cellulare e incubare a temperatura ambiente per 5 min per fissare le cellule. Centrifugare la sospensione per 30 min a 16.000 x g per ottenere un pellet duro. Scartare il supernatante e sostituire con l’1% di saccarosio nella salina con buffer fosfato (PBS). Conservare i pellet nel saccarosio a 4 gradi centigradi fino a sezionare per la microscopia elettronica. Sezionamento e TEMNOTA: il protocollo riportato di seguito è adattato da Griffiths etal. Cryoproteggere il pellet cellulare incorporandolo in 2,1 M di saccarosio in PBS durante la notte a 4 gradi centigradi. Lavare 3x con acqua ghiacciata. Raffreddare i pellet cellulari crioprotetti in azoto liquido e montarli mozziconi di criomicrotomia. Utilizzando il criomicrotome, tagliare le sezioni ultrasottili a 90 nm. Recuperate le sezioni tagliate utilizzando i loop di filo di tungsteno di 1:1 miscela di cellulosa metile 2% e 2,1 M di saccarosio in PBS. Trasferire le sezioni a pioloform rivestito 150 maglie rame esagonale supporti TEM (griglie) e conservare a 4 gradi centigradi o procedere al passaggio 5.4.5. Contrapporre le griglie in acetato di uranilo e asciugare all’aria in una pellicola di acetato di metile. Lavare le griglie con acqua ghiacciata seguita da due gocce di PBS oltre 5 min e asciugarle per 15-30 min. Esaminare le sezioni in base alle linee guida del TEM seguendo le linee guida del produttore. NOT:</ Tutte le fasi di etichettatura sono state eseguite a temperatura del ghiaccio (temperatura liquida) ad eccezione delle fasi di lavaggio, che sono state eseguite a temperatura ambiente.

Representative Results

Il calore inattiva tutti i M. tuberculosis bacilliLa densità ottica (OD) dei controlli (cellule vive) è aumentata nel tempo (0,04OD–0,85OD) e non è stata osservata alcuna variazione OD nei campioni inattivati dal calore, che indica rispettivamente la crescita e nessuna crescita (Figura 1)27. Allo stesso modo, l’espettorato clinico di controllo è cresciuto positivo al giorno 3 in MGIT, mentre i campioni clinici inattivati dal calore non sono stati segnalati positivi fino alla fine dell’incubazione. La crescita di Mtb in MGIT è stata confermata dalla microscopia dello striscio di ieehl-Neelsen e dall’antigene MPT6429. L’RNA nei campioni inattivati è stabile a 37 gradi centigradi per 4 giorniI campioni inattivati dal calore sono stati incubati a 37 gradi centigradi per determinare se l’RNA si degrada a seguito dell’inattivazione di calore delle cellule. Non è stata riscontrata alcuna differenza tra l’RNA raccolto al giorno (D) 0 immediatamente dopo l’inattivazione del calore e l’RNA isolato a D1, 2, 3 e 4 in entrambe le colture BCG (Figura 2A-C) e l’espettorato positivo della TB ( Figura2D). RNase esogeno aumenta il tasso di degradazione dell’RNA nelle frazioni inattivate dal calorePer determinare il motivo per cui l’RNA non era degradante, l’enzima RNase A è stato aggiunto esogenamente a 1.000 U/mL prima e/o dopo l’inattivazione del calore. Ciò ha causato una perdita di RNA equivalente al carico batterico di 1,5 x 0,3 -, 1,8 – 0,2 -, e 1,3 – 0,1 – log10 eCFU/mL rispettivamente a 80 , 85 gradi e 95 gradi centigradi in 4 giorni di incubazione. C’era una differenza nell’RNA degradato nei campioni in cui RNase è stato aggiunto prima e/o dopo l’inattivazione del calore (Figura 3A-C). L’RNA è conservato per TB-MBLA usando 16S rRNA come marcatore di riferimentoL’effetto dell’inattivazione del calore sull’RRNA è stato misurato nelle colture BCG e nell’espettorato da pazienti con TB positivi. Il carico batterico misurato della coltura BCG di controllo, 5,3 x 0,2 log10 eCFU/mL, era pari a 0,2 x 0,1 log10 eCFU/mL superiore al log combinato di 5,1 0,3 log10 eCFU/mL di27coltura inattiva termica (ANOVA p < 0.0001) a 80 C, 85 C e 95C. Allo stesso modo, il carico batterico dell’espettorato del paziente di controllo, 7,1 log10 eCFU/mL, era di 0,8 x 0,1 log10 eCFU/mL superiore al log combinato di 6,3 – 0,41 log10eCFU/mL a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi e 95 gradi centigradi (Figura 4B)27. La riduzione del carico batterico è stata <1log nei due tipi di campioni testati. Il test di confronto multiplo di Sidak ha rivelato una differenza significativa tra il carico batterico a 95 gradi centigradi rispetto a quello di 80 e 85 gradi centigradi.001. Non è stata riscontrata alcuna differenza nei campioni di TB a tutte le temperature, p – 0,8. L’integrità della parete cellulare non viene distrutta dal calore nella maggior parte delle cellule MtbUtilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) abbiamo studiato se le cellule fossero lisviate dall’inattivazione del calore. Sottili sezioni di pellet fissi di paraformaldeide sono state fatte e incorporate in un mezzo ricco di elettroni prima dell’esame da TEM. L’ispezione delle cellule con un ingrandimento inferiore e superiore ha rivelato una parete cellulare intatta e corpi lipidici intracellulari visibili. Le cellule apparivano morfologicamente allungate ma non lisciviate. La figura 5 illustra la morfologia delle cellule di mycobacterium con diversi ingrandimenti. I due pannelli superiori rivelano corpi lipidici intracellulari e il cordone senza corda, una caratteristica morfologica tipica delle specie di miccobacterio. I due pannelli inferiori sono più alti ingrandimento espandendo la vista dei corpi lipidici e rivelando alcune strutture micro-intracellulari. Il carico batterico misurato da TB-MBLA è inversamente correlato al tempo di coltura MGIT alla positivitàPer i pazienti che rispondono alla terapia, il carico batterico cade in media 1 log10 eCFU/mL a settimana nel corso del trattamento. I risponditori veloci si rilassano più velocemente, convertendosi in negativo (carico batterico zero) di 2 settimane di trattamento. Il calo del carico batterico misurato da TB-MBLA corrispondeva all’aumento del tempo di coltura MGIT alla positività (TTP). La figura 6 mostra la correlazione inversa trovata tra carico batterico e TTP MGIT. La differenza, tuttavia, è che i risultati TB-MBLA sono disponibili in 4 h e il time-to-result è indipendente dal livello di carico batterico. Questo è in contrasto con 5-25 giorni per i test di coltura MGIT. La contaminazione con batteri non TB compromette ulteriormente i risultati dei test di coltura. Figura 1: Verifica dell’inattivazione di BCG a 80 gradi (curva del modello a punti), 85 gradi (curva del motivo punto-trattino) e 95 gradi (curva del modello di trattino). La cultura BCG di controllo (curva nera) era inoculata inoculata nello stesso mezzo di crescita. La crescita del controllo è stata confermata dall’aumento della OD della coltura nel periodo di incubazione. Questa cifra è stata modificata da Sabiiti et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Stabilità dell’RNA quantificabile nel campione inattivato dal calore incubato a 37 gradi centigradi per 4 giorni (D0-D4). (A), (B) e (C) mostrano le colture BCG inattivate rispettivamente a 80 , 85 e 95 gradi centigradi. (D) indica l’espettorato della TB inattivato a 80 gradi centigradi. Il controllo è la frazione non trattata (live) dello stesso campione. Barre di errore: deviazione standard. Tre ripetizioni, nove repliche per corsa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Maggiore degradazione dell’RNA dopo l’aggiunta esogena dell’enzima RNase A. (A) Inattivazione del calore (HI) a 80 gradi centigradi, (B) HI a 85 gradi centigradi e (C) HI 95 gradi centigradi. Barre di errore: errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: La conservazione di RNA sufficiente per la misurazione del carico batterico TB-MBLA utilizzando 16S rRNA come marcatore. (A) Carico batterico stimato dalle colture BCG in vitro. (B) Carico batterico stimato dall’espettorato positivo alla tubercolosi. Barre di errore: errore standard della media (n – 18 e 20 repliche rispettivamente per A e B). Questa cifra è stata modificata da Sabiiti et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Micrografie elettroniche di bacilli Mtb intatti dopo l’inattivazione a 95 gradi centigradi per 20 min. Con TEM sono stati osservati chiari muri cellulari intatti e corpi lipidibili enumerabili. In alto: immagini a basso ingrandimento di un gruppo di cellule che rivelano una morfologia corda micobatterica non ostacolata e corpi lipidi intracellulari. In basso: alto ingrandimento dei pannelli superiori per espandere la vista dei corpi lipidici e rivelare alcune strutture micro-intracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: La curva di risposta al trattamento di 12 settimane di un paziente sulla terapia anti-TB che mostra una correlazione inversa tra TB-MBLA misurato carico batterico e TTP MGIT. Il carico batterico (curva blu) cade mentre il TTP sale (curva rossa) mentre il paziente risponde al trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Master mix Reazione positiva RT Reazione negativa RT Volume per reazione x no. delle reazioni n. 5 Volume per reazione x no. delle reazioni n. 5 Miscela Quantitect 10,0 L (L) 10,0 L (L) Miscela di primer Mtb16S (F 0,4 l l 0,4 l l Sonda Mtb16S 0,2 l l 0,2 l l Miscela di primer CE (F 0,4 l l 0,4 l l Sonda CE 0,2 l l 0,2 l l Enzima RT 0,2 l l ——- RNase acqua libera 4,6 l 4,8 l l Volume totale 16 ll 16 ll Tabella 1: Guida alla preparazione del mix master per il TB-MBLA qPCR. digitare Canale MTB Canale CE Interpretazione Esempio Positivo Positivo Valido Esempio Positivo Negativo Indeterminato Esempio Negativo Positivo Valido Esempio Negativo Negativo Non valido MTB – Controllo Positivo Negativo Valido Controllo dell’estrazione (CE) Negativo Positivo Valido Controllo del DNA Negativo Negativo Valido Controllo negativo (NTC) Negativo Negativo Valido Tabella 2: Guida all’interpretazione dei risultati TB-MBLA.

Discussion

Questo articolo mostra che il trattamento termico per 20 minuti a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi e 95 gradi di tubercolosi inattiva efficacemente i campioni di tubercolosi, rendendo possibile l’esecuzione di TB-MBLA in un impianto non CL3 senza rischio di infezione per i lavoratori di laboratorio. I risultati confermano le osservazioni fatte in studi precedenti, mentre in contrasto con alcune sull’efficacia dell’inattivazione del calore di Mtb²⁵^,³⁰. Per esempio, alcuni rapporti indicano che il riscaldamento a 80 gradi centigradi non è efficace su campioni di carico ad alta bacillari²⁵^,³¹^,³²^,³³. L’effetto inoculum ad alta densità è stato evitato nel nostro studio assicurando che tutti l’espettorato e le colture pure fossero riscaldate a un volume da 1 mL per tubo di centrifugazione da 15 mL fornendo spazio adeguato per esporre ogni parte del campione all’ebollizione²⁷.

La conservazione dell’RNA in seguito all’inattivazione del calore rende possibile l’esecuzione di TB-MBLA. Questa scoperta concorda con due studi che hanno dimostrato la conservazione dell’RNA dopo l’inattivazione del calore¹²^,³⁴. Abbiamo dimostrato che l’RNA nei campioni inattivati dal calore è stabile a 37 gradi centigradi per 4 giorni, il che implica che i laboratori potrebbero fare test in batch mantenendo i campioni inattivati a temperatura ambiente per una settimana. Applicando kit di estrazione dell’RNA che richiedono refrigerazione o congelamento, la capacità di mantenere i campioni inattivati dal calore a temperatura ambiente elimina la necessità sia della catena del freddo che dei laboratori di categoria 3 per eseguire TB-MBLA in ambienti con risorse limitate.

Il carico batterico di 1log è stato perso usando il rRNA 16S come marcatore. Anche se c’era una differenza tra campione inattivato dal vivo e calore, la quantità persa per inattivazione del calore è troppo piccola per compromettere i risultati a valle. L’aumento della temperatura non ha aumentato la quantità di RNA perso, il che implica che la perdita osservata è indipendente dal trattamento termico. Il trattamento termico ad alte temperature causa molto probabilmente la lisi cellulare, esponendo l’RNA alla degradazione da parte di RNases. Infatti, l’aggiunta esogena di RNase A alla frazione inattivata dal calore ha aumentato il tasso di degradazione dell’RNA. L’ebollizione non ha ridotto l’attività di RNase, il che implica che si tratta di una proteina molto resistente.

È importante notare che una degradazione media dell’RNA di 1,5 log₁₀eCFU/mL non è una grande perdita. A tal fine si ipotizza che il riscaldamento lisi una piccola parte di Mtb bacilli, esponendo così una piccola quantità di RNA a RNase. Utilizzando TEM abbiamo dimostrato che la morfologia e l’integrità delle pareti cellulari delle cellule Mtb non sono influenzate dal riscaldamento a 95 gradi centigradi. Ciò significa che può richiedere vari fattori fisiologici e un apporto sufficiente di RNasi come nell’ospite per degradare significativamente L’RNA³⁵^,³⁶. Inoltre, essendo un ribosoma strutturale, 16S rRNA è potenzialmente meno suscettibile a RNase³⁷^,³⁸. Una singola cella Mtb contiene 700 ribosomi/0,1 mm³ di citoplasma³⁷, il che implica che ci sono maggiori quantità di rRNA per cellula. Pertanto, piccole quantità di RNase possono avere un impatto minore³⁸. L’esistenza di un elevato numero di ribosomi dà un vantaggio alla TB-MBLA in termini di sensibilità e capacità di rilevare i pazienti a basso carico di lavoro.

C’era una forte correlazione tra il carico batterico misurato da TB-MBLA e MGIT culture TTP. Questo conferma il carico batterico come motore della positività culturale in una certa misura. Tuttavia, il vantaggio di TB-MBLA è che quantifica direttamente il carico di bacchezza presente nel campione e non richiede la proliferazione delle cellule Mtb prima del rilevamento. Questo contrasta con la cultura il cui tempo di positività dipende dal livello di carico batterico e dalla velocità di proliferazione cellulare Mtb. Studi futuri valuteranno il flusso di lavoro TB-MBLA, inclusa l’inattivazione del calore, in ambienti clinici di routine. Lo studio esplorerà anche campioni con una serie di carichi batterici per capire il numero che potrebbe cambiare da positivo a negativo (cioè quelli con meno batteri in seguito all’inattivazione del calore).

Il protocollo TB-MBLA per la quantificazione molecolare del carico batterico è il primo del suo genere in batteriologia. Il metodo quantifica direttamente il carico batteriale Mtb dall’espettorato del paziente e non richiede alcuna coltura per farlo. Questo lo rende più veloce e aumenta il suo potenziale per informare una decisione clinica sul progresso del paziente. La fase di inattivazione del calore riduce il rischio di infezione e aumenta l’applicabilità di TB-MBLA in ambienti che non dispongono di un laboratorio di categoria 3. In seguito all’inattivazione termica del campione, ci sono tre passaggi di protocollo per ottenere risultati TB-MBLA: estrazione di RNA, trascrizione inversa (RT)-qPCR e analisi dei risultati qPCR.

Maggiore è l’efficienza di isolare l’RNA Mtb da un campione di pazienti, maggiore è la qualità dei risultati. È importante notare che la qualità del campione di espettorato influisce sulla quantità di RNA isolato. Ad esempio, l’espettorato salivare è considerato di bassa qualità ed è stato associato a un basso carico di bacillario. Ciò significa che è importante allenare il paziente all’aspettativa dell’espettorato di qualità. Per valutare l’efficienza del processo di estrazione, un controllo di estrazione (cioè il numero noto di cellule non-Mtb) è a spillo nel campione prima dell’estrazione dell’RNA. Il recupero del controllo di estrazione conferma l’efficienza del processo di estrazione dell’RNA. Il processo di isolamento dell’RNA non può essere valido a meno che il controllo di estrazione non sia stato recuperato. Dato che Mtb è un organismo resiliente rende la lisi meccanica una parte cruciale del processo. L’omogeneizzazione del campione ad alta velocità (600 giri/min) in presenza di perline (cioè matrice liscivia) lisci letali le cellule. La purificazione del lisato produce un estratto contenente sia l’RNA che il DNA. La rimozione del DNA è un ultimo passo cruciale dell’estrazione dell’RNA. TB-MBLA mira a misurare bacilli vitali quantificando l’RNA. Pertanto, la mancata rimozione del DNA genomico significa che i risultati avranno un segnale dal DNA, che non è un buon marcatore per la vitalità cellulare⁶.

L’RT-qPCR è un duplex con sonde dual labelcon per Mtb e controllo di estrazione. Si tratta di tre passaggi: trascrizione inversa di 30 min per trascrizione inversa a 50 gradi centigradi, denaturazione di 15 min a 95 gradi centigradi e 40 cicli di amplificazione a 94 e 60 gradi centigradi. L’acquisizione della fluorescenza dalle sonde avviene a 60 gradi centigradi (cioè la fase di allungamento del frammento). È importante notare che il TB-MBLA è stato ottimizzato utilizzando una particolare macchina qPCR, quindi gli operatori che utilizzano altre piattaforme qPCR dovrebbero ottimizzare le condizioni per le loro apparecchiature. L’efficienza della rimozione del DNA è controllata eseguendo una singola reazione per campione in assenza di RT. Un risultato positivo da questa reazione significa la rimozione incompleta del DNA. I campioni ad alto carico di peso che hanno elevate quantità di DNA possono richiedere il doppio della quantità di enzima DNase per rimuovere completamente il DNA. Fortunatamente, in campioni di carico di alta bacillari, la presenza di piccole quantità di DNA ha meno probabilità di influenzare il risultato dell’RNA. L’RNA ribosomico, il bersaglio TB-MBLA, si verifica naturalmente in un valore doppio della quantità di DNA³⁷. Nella PCR, un controllo senza modello (NTC), che è l’acqua utilizzata per sciogliere i reagenti PCR, controlla la contaminazione incrociata con DNA o RNA esogeno. Un segnale positivo nel NTC implica contaminazione incrociata e il risultato considerato non valido. Ciò significa che tutte le soluzioni costituite con quest’acqua devono essere scariate e quelle nuove realizzate con una fiala d’acqua fresca. Si consiglia di tenere l’acqua PCR in separa per evitare la contaminazione di tutta l’acqua. Un controllo positivo (Mtb RNA) viene utilizzato per controllare l’efficienza complessiva della PCR.

L’analisi dei risultati comporta la conversione dei Cq PCR in carico batterico (cioè le unità di formazione della colonia stimate per mL) utilizzando la curva standard. L’impostazione e l’ottimizzazione della curva standard sono fondamentali per questo passaggio. Si consiglia un’efficienza di curva standard di 0,95–1. Le curve standard per la MTb e il controllo dell’estrazione devono essere impostate e ottimizzate prima che i pazienti o altri campioni di prova vengano eseguiti sulla macchina. I campioni standard sono forniti con il kit TB-MBLA. Per la PCR si raccomanda una diluizione di dieci volte dell’estratto di RNA. Ciò implica che il risultato del carico batterico deve essere moltiplicato per un fattore di 10 per ottenere il risultato finale del carico batterico per mL. È importante notare che i Cq superiori a 30 sono considerati negativi per TB-MBLA. È necessario un minimo di due potenziali risultati di carico batterico misurati in diversi punti temporali per fare un’inferenza sulla risposta al trattamento. Si raccomanda vivamente che uno dei due risultati dovrebbe essere al basale, prima dell’inizio del trattamento. Tuttavia, se la valutazione del carico batterico iniziata dal paziente si verifica a metà del trattamento, deve essere effettuata una misurazione del carico batterico a un secondo punto temporale per valutare la risposta al trattamento. TB-MBLA è in grado di distinguere il carico batterico in uno spazio di 3 giorni durante il trattamento, ma l’ideale sono due misurazioni del carico batterico effettuate a 7 giorni di distanza.

Mentre il protocollo genera risultati quantitativi informativi per la risposta al trattamento, è ancora in gran parte manuale e richiede notevoli mani sul tempo per l’estrazione dell’RNA. I tecnici dei laboratori occupati potrebbero non avere questo tempo. Sono in corso accordi per automatizzare i processi di estrazione dell’RNA e PCR.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato reso possibile dal finanziamento del partenariato europeo e dei paesi in via di sviluppo (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion Program (Pan African Biomarker Expansion Program) SP.2011.41304.008. Il sostegno è stato ottenuto anche il grant di ricerca della University of St Andrews School of Medicine. La pubblicazione di questo manoscritto e del protocollo TB-MBLA come risorsa visiva è stata resa possibile dai finanziamenti del Consiglio di finanziamento scozzese e del Global Challenges Research Fund all’Università di St Andrews. Grazie all’ospedale materno di Maputo e al Mavalane Health Centre che ha fornito i campioni di espettorato clinico, e al team dell’Unità di trattamento della tubercolosi maputo che ha contribuito agli esperimenti di inattivazione del calore di campioni di espettorato clinico.

Materials

Heat inactivation:
15 mL Centrifuge tubes	Fisher-Scientific	10136120	50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved
15 mL Wire Tube rack	Fisher-Scientific	11749128	Other brands with similar make can be used
Water bath	Fisher-Scientific	15700619	Other brands with similar make can be used
RNA extraction:
Chloroform	Sigma	372978-1L	Not necessary in other RNA extraction kit brands
Ethanol, absolute 99-100%	Sigma	51976-500ML-F	Larger volume available
Extraction control	SOI group St Andrews	VitalbacteriaEC	Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit
FASTRNA Pro blue Kit	MP Biomedicals	116025050	Supplied with lysing matrix tubes
Molecular grade water (RNase free)	Sigma	W4502-1L	Qiagen, Fisherscientific can also supply same product
Precellys 24 homogeniser	VWR	432-3750	FastPrep MP Biomedicals can be used too
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus	Fisher-Scientific	15352117	Other brands with similar capacity can be used
Thermomixer	Eppendorf	BLD-455-010C	Works with 1-2 mL tubes
TURBO DNA-free	Fisher-Scientific	AM1907M	Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures.
RT-qPCR:
Primers and Taqman probes	SOI group St Andrews	VitalbacteriaPP	Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit	Qiagen	204845	PCR mix plus the RT enzyme
RotorGene Q 5plex machine	Qiagen	9001580	Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml	Qiagen	981103	Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed.
Non-heat inactivation Sample preservation materials
1M Tris-HCl pH 7.5	Sigma	93313	Supplied ready to use
2-Mercaptoethanol	Sigma	63689	Many competent suppliers
Guanidine thiocyanate (GTC)	Promega	V2791	Promega brand recommended for quality
Molecular grade water (RNase free)	Sigma	W4502-1L	Ensures that GTC solution is free of nucleases
General materials (used but not specific to TB-MBLA)
500 mL plastic containers		734-5087	Nalgene brand recommeded
Biological waste discard jars			Many competent suppliers
Chemical waste discard jars			Many competent suppliers
Disposable gloves, chemical resistant			Many competent suppliers
Freezer (-20 °C)			Many competent suppliers
Freezer (-80 °C)			Many competent suppliers
Fridge (0-8 °C)			Many competent suppliers
Fume hood			For safe handling of toxic reagents
Laboratory scales			For accurate measurement of reagents
Measuring cylinders, plastic			To ensure accurate measurement of reagents
PCR reaction tubes			Should be suitable to the PCR instrument used
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips,			DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended
Qiagility loading plates	Qiagen		5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates
QIAgility Pipetting Robot	Qiagen		Important for high throughput pipetting
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes			Chemical-resistant and autoclavable recommended
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space)	Fisher Scientific	10666421	Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme
Safety goggles, chemical resistant	Fisher Scientific		Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents.
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL			Many competent suppliers
Sterile RNAse-free microtubes			1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse			Ensure it is freshly prepared or prepared within a week
Vortex			Genie 2 brand recommended
Transmission electron microscopy
Glutaldehyde (8%)	Sigma	G7526-10ML	Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
HEPES (pH 7.4, 100 mM)	Sigma	H4034-25G	Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Leica FCS ultracryo	Leica		Cryomicrotome for tissue sectioning
Methyl cellulose	Agar Scientific	AGG6425	Cold mounting resin
Paraformaldehyde (4% in PBS)	Sigma	P6148-500G	Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Sucrose	Sigma	84097-250G	Preservation and mounting medium
Uranyl acetate	Agar Scientific	AGR1260A	Universal Electron microscopy stain

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Etiketler

Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)Tuberculosis Disease Burden Anti-tuberculosis Medication Treatment Response Quantitative Result Nontuberculous Mycobacteria Chronic Obstructive Pulmonary Disease Bacille Calmette-Guerin (BCG)Sputum Samples RNA Extraction Phenol Chloroform Extraction Control

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Sabiiti, W., Mtafya, B., De Lima, D. A., Dombay, E., Baron, V. O., Azam, K., Oravcova, K., Sloan, D. J., Gillespie, S. H. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). J. Vis. Exp. (158), e60460, doi:10.3791/60460 (2020).