结核病分子细菌负荷测定（TB-MBLA）

1. 样品制备 文化 在干净的长凳或 1 类舱内工作，将 1 mL 的指数级杆菌（BCG）培养成 15 mL 塑料离心管。紧紧闭管。注：要处理整个 5 mL 样品，需要 5 个 15 mL 离心机管。注意：使用任何结核病培养体时，需要一个生物安全柜。 患者痰标本 在通风良好的空间工作，并戴上鼻罩，小心地打开试样杯，将1 mL等位体插入15 mL塑料离心管，并紧紧关闭管子。注：建议用宽口尖进行移液痰。使用一把剪刀，剪下1 mL尖嘴的细部分，以创建一个更宽的嘴。 2. 热失活 在样品制备之前，将水浴设置为 95°C。注：95°C温度增加了减少RNase活性的机会，从而为下游结核-MBLA保存更多的RNA。 将样品管转移到浸入水浴中的保持架。确保每个样品管的四分之三浸入水中。 在95°C下煮20分钟，然后将管子转移到工作台上，在室温下冷却5分钟，然后开始提取RNA。注：通过孵育热灭活样品和控制在37°C下42天，验证M.结核病杆菌和BCG完全热灭活，以验证生长。在基线处进行600nm（OD600）的光学密度测量，然后每周进行42天的潜伏期。 3. RNA 提取 注：此处描述的RNA提取过程适用于材料表中列出的RNA试剂盒。其他合适的RNA萃取试剂盒可用于不同制造商。 提取控制 （EC） 添加 将热灭活样品的 1 mL 等位值转移到 1.5 mL 管中。将 EC 的 100 μL 刺入每个样品，关闭管，并通过倒置管子倒置 3 倍混合。注：EC 随附 TB-MBLA 重要细菌试剂盒（材料表）。 细胞沉淀 使用台式微离心机，在室温下以 20，000 x g的离心机 10 分钟。移液器从上清液中脱落，留下50μL的沉积物。 通过上下移液将950μL的液解缓冲液悬浮在950μL中的沉积物，并将整个悬浮液转移到RNA萃取试剂盒（材料表）附带的浸结基管中。确保管紧闭，并标记管的盖子和侧面。 对于细胞水成酶，将管子从步骤 3.2.2 转移到均质器。在 6，000 rpm 下将样品均匀化为 40 s。 核酸纯化 在室温下，将水电解质从步骤 3.3 以 12，000 x g进行 5 分钟离心。 准备新鲜的1 mL管，在每个管中加入300μL的氯仿。 在不接触压液基质的情况下，小心地将 1 mL 尖端移出上清液。 将上清液转移到含有管和涡旋的氯仿中5秒。离开管子沉淀5分钟或更长时间，直到三个阶段（上、中、下）清晰可见。 在室温下，在 12，000 x g下离心 5 分钟。小心地移移上相，并转移到新鲜的1.5 mL管中。 在步骤 3.4.5 中的管中，加入 500 μL 的冷 100% 乙醇，关闭管，然后轻轻倒置 3 倍混合。在-80°C孵育15分钟或-20°C30分钟，继续提取，或留在-20°C过夜，以完成第二天的提取。 将微离心机设置为 4°C，在开始离心之前冷却至至少 12°C。将管子装入微离心机和离心机20分钟，在13，000 x g。丢弃上清剂，用70%的冷乙醇代替，在13，000 x g下再用离心机10分钟。注：70%乙醇应用分子级无核酸水制成。 丢弃步骤 3.4.7 中的所有上清液，并将管子转移到 50°C 的培养箱中。孵育20分钟，干燥RNA/DNA颗粒。保持管部分打开，使所有乙醇蒸发。 将 100 μL 的无核酸酸水添加到干颗粒中，并在室温下孵育 5 分钟。涡旋为3s混合的内容。注：在此阶段，提取物可在-80°C下储存在冰箱中2~3天或更长时间，直到执行第3.5节。 脱氧核糖核酸去除注：此步骤至关重要，因为提取物中存在 DNA 会使 MBLA 结果失效。本部分基于脱氧核糖核酸去除试剂盒（材料表）。 制备酶DNase I 10倍缓冲液和DNase I酶的组合，用于样品数量（每个样品10μL缓冲液和1 μL的DNase），外加10%的额外，以覆盖移液造成的任何损失。通过涡旋混合，然后移液器11μL进入每个含有RNA提取物的管。 通过涡旋 3 s 混合，然后短暂旋转（10 s 在 13，000 x g下），以去除墙壁上的任何液滴。在37°C下在热块或培养箱中孵育30分钟。将另外1μL的DNase I酶直接加入每个管中，通过涡旋混合好，并在37°C下再孵育30分钟。 在DNase孵育结束前10分钟解冻DNase灭活试剂。Vortex 20s 确保同质乳质悬浮液，然后从步骤 3.5.2 将 10 μL 的 DNase 灭活试剂添加到每个 RNA 提取物中。 在室温下孵育混合物5分钟。 Vortex 3x在5分钟孵育步骤期间。 将混合物在 13，000 x g下离心 2 分钟。小心地将上清液转移到 1.5 mL 无纳塞自由管，而不接触任何失活基质。 如果在同一天运行RT-qPCR或-80°C，长期储存，则将RNA提取物储存在冰箱中。 4. 反向转录酶 qPCR 对于未知样品，稀释所有RNA提取物，在无Nase水中以1：10的比例使用。通过涡旋 5 s 和短暂向下旋转以去除任何液滴或气泡，混合良好。 对于标准曲线的标准样品，从 -80°C 冰柜中取出 Mtb 和 EC RNA 标准，并在室温下解冻。分别制作 Mtb 和 EC 标准样品的 7 倍和 6 个 10 倍稀释。在将混合物从一个管转移到另一个管子之前，先更换提示。注：标准样品随 TB-MBLA 套件一起提供。 主混合准备注：主混合 （MM） 是 PCR 试剂的解决方案，足以放大所有样品、标准和水，实现无模板控制 （NTC）。用作NTC的水应与提取和制备MM所用的水相同。确保标准、每个RNA样品及其十进制稀释被放大2倍，用于逆转录酶阳性（RT+）反应，1倍用于反向转录酶阴性（RT-）反应。RT-反应是确定脱氧核糖核酸去除效率的控制（表1）。 将 16 μL MM 传输到每个 PCR 反应管中。 将4μL的RNA提取物加入每个RT+和RT-反应管和水到NTC反应管中。 将反应管加载到实时PCR机器中，并将PCR条件设定如下：50°C，30分钟，95°C为15分钟，40倍循环在94°C45s，60°C为1分钟，与吸入绿色和黄色通道的氟波波波进行采集。注：绿色通道是Mtb检测荧光，黄色是提取控制检测荧光。 结果解释注：确保同一样本的重复反应差异不超过 1 个标准差。Mtb 和高于 30 的 EC Cq 值被视为负值。请参阅表 2中的进一步解释详细信息。 要解释处理响应，请使用标准曲线将 Cq 值转换为细菌负载 （eCFU/mL）。阅读治疗响应，作为治疗随访期间细菌负荷的变化。注：治疗后细菌负荷的下降意味着积极的反应（即杀灭结核菌的抗结核药物），而细菌负荷没有变化或上升意味着负反应，这可能意味着结核菌对抗结核药物的抗药性或患者没有适当坚持其治疗剂量。TB-MBLA 测量的细菌载量下降与 MGIT 时间增加与培养积极性 （TTP） 相关。 5. 传输电子显微镜 将 2 mL 热灭活培养物和控制装置转移到 2 mL 微离心管中。在 20，000 x g下离心 10 分钟。 丢弃上清液，将颗粒悬浮在700μL的细胞固定缓冲液中，并在室温下孵育5分钟以固定细胞。 在 16，000 x g下将悬架离心 30 分钟，以获得坚硬的颗粒。丢弃上清液，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中用 1% 蔗糖代替。将颗粒储存在4°C的蔗糖中，直到分片进行电子显微镜检查。 切片和 TEM注：下面的协议改编自格里菲斯等人28。 通过在4°C下在PBS中过夜，将细胞颗粒嵌入2.1M蔗糖中，从而冷冻保护细胞颗粒。用冰冷的水洗3倍。 冷却液氮中的冷冻细胞颗粒，并安装低温粒。使用低温微孔，在 90 nm 处切割超薄截面。 使用PBS中1：1混合物的钨线环（2%甲基纤维素和2.1M蔗糖）取回切割部分。 将截面转移到皮奥洛形涂层 150 网状六角铜 TEM 支架（网格），并在 4°C 下存储或继续步骤 5.4.5。 在醋酸化薄膜中对比醋酸酯和空气干燥的电体。用冰冷的水清洗电网，然后两滴PBS超过5分钟，干燥15~30分钟。注：除在环境温度下进行的洗涤步骤外，所有标签步骤均在冰温（液体温度）下执行。