Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Jodie Hay; Michael  W. Moles; Jennifer Cassels; Alison  M. Michie

doi:10.3791/60426

JoVE Journal > Cancer Research

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Kanser Araştırmaları

Subzelluläre Fraktionierung der primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Überwachung des nuklearen/zytoplasmatischen Proteinhandels

Published: October 23, 2019

doi:

10.3791/60426

Jodie Hay*¹, Michael W. Moles*¹, Jennifer Cassels¹, Alison M. Michie¹

¹Paul O’Gorman Leukaemia Research Centre, Institute of Cancer Sciences, College of Medical, Veterinary and Life Sciences,University of Glasgow

Özet

Dieses Protokoll ermöglicht die Optimierung und anschließende effiziente Generierung von kern- und zytoplasmatischen Fraktionen aus primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen. Diese Proben werden verwendet, um die Proteinlokalisierung sowie Veränderungen im Proteinhandel zu bestimmen, die zwischen den kerntechnischen und zytoplasmatischen Kompartimenten nach Zellstimulation und medikamentöser Behandlung stattfinden.

Abstract

Der nukleare Export von Makromolekülen wird oft in Krebszellen dereguliert. Tumorsuppressorproteine, wie p53, können aufgrund einer abnormen zellulären Lokalisierung, die ihren Wirkmechanismus stört, inaktiv gemacht werden. Das Überleben chronischer lymphatischer Leukämiezellen (CLL) wird unter anderem durch die Deregulierung der nuklearen auf zytoplasmatische Abschaltung unterstützt, zumindest teilweise durch Deregulierung des Transportrezeptors XPO1 und die konstitutive Aktivierung PI3K-vermittelte Signalwege. Es ist wichtig, die Rolle einzelner Proteine im Kontext ihrer intrazellulären Lage zu verstehen, um ein tieferes Verständnis der Rolle solcher Proteine in der Pathobiologie der Krankheit zu gewinnen. Darüber hinaus wird die Identifizierung von Prozessen, die der Zellstimulation und dem Wirkmechanismus spezifischer pharmakologischer Inhibitoren im Zusammenhang mit dem subzellulären Proteinhandel zugrunde liegen, ein umfassenderes Verständnis des handeln. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Optimierung und anschließende effiziente Generierung von kern- und zytoplasmatischen Fraktionen aus primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen. Diese Fraktionen können verwendet werden, um Veränderungen im Proteinhandel zwischen den kernnuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen bei der Zellstimulation und der medikamentösen Behandlung zu bestimmen. Die Daten können quantifiziert und parallel zu immunfluoreszierenden Bildern dargestellt werden, so dass robuste und quantifizierbare Daten zur Verfügung stehen.

Introduction

Der Transport von Makromolekülen zwischen dem Kern und dem Zytoplasma hat sich längst etabliert, um eine Schlüsselrolle in der normalen zellulären Funktion zu spielen und wird oft in den Krebszellen¹^,²dereguliert. Eine solche Deregulierung kann sich aus einer Überexpression/Mutation von Proteinen ergeben, die den Nuklearexport steuern. Ein solches Protein Exportin-1 (XPO1) ist ein Transportrezeptor, der >200 Kernexportsignale (NES)-haltige Proteine aus dem Kern²in das Zytoplasma exportiert. XPO1-Cargos umfassen p53, FOXO Familienmitglieder und IB, die zu ihrer Inaktivierung beitragen, indem sie ihren Wirkmechanismus¹^,²^,³hemmen. Eine weitere Proteinfehllokalisierung kann auftreten, wenn Mikroumweltsignale auf die Krebszellen einwirken, was zur Aktivierung intrazellulärer Signalwege wie der Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K)/Akt-Signalweg führt, was zu Inaktivierung von FOXO-Familienmitgliedern und anschließender Export aus dem Kern⁴^,⁵. Eine solche Fehllokalisierung von Tumorsuppressorproteinen wurde in das Fortschreiten einer Reihe von hämatologischen und soliden Tumoren¹^,²^,⁶verwickelt.

Die Entwicklung von kleinen Molekülinhibitoren für den klinischen Einsatz bei hämatologischen Malignitäten (akute myeloische Leukämie (AML)/CLL), die an die XPO1-Funktion binden und diese selektiv hemmen, unterstreicht, wie wichtig es ist, geeignete Techniken zur Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe auf die Abschaltung von Proteinen zwischen den Kern- und Zytoplasmakomden⁶^,⁷^,⁸. Bildgebende Verfahren haben die Identifizierung von Proteinen in subzellulären Kompartimenten bei externer Stimulation medikamentöser Behandlungen erheblich verbessert, jedoch ist die Bedeutung robuster und unterstützender paralleler Techniken entscheidend, um zuverlässig ein wissenschaftliches Publikum über die Gültigkeit eines Ergebnisses zu informieren.

Ruhende Lymphozyten und bösartige CLL-B-Zellen, die aus Patientenblutproben isoliert sind, stellen aufgrund des hohen kernnuklearen Zytoplasma-Verhältnisses eine Herausforderung bei der Erzeugung von kerntechnischen und zytoplasmatischen Fraktionen dar. Die Optimierung der experimentellen Bedingungen zur Erzeugung robuster und zuverlässiger experimenteller Daten ist natürlich entscheidend, um zukünftige experimentelle Programme zu planen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Quantifizierung von Proteinen in den kernnuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen und bestimmt, wie diese Proteine durch zelluläre Stimulation und/oder medikamentöse Behandlung beeinflusst werden können.

Protocol

Die Verwendung von Primärproben von CLL-Patienten, die hier beschrieben wurden, wurde vom West of Scotland Research Ethics Service, NHS Greater Glasgow und Clyde (UK) genehmigt, und alle Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt. 1. Isolierung von CLL-Zellen aus Patientenblutproben Periphere Blutproben von zuvor genehmigten CLL-Patienten werden aus der Klinik in EDTA-Blutentnahmeröhrchen, begleitet von der Anzahl der weißen Zellen (WCC), erhalten. Reinigen Sie die peripheren Blut-CLL-Proben nach dem ÖRK. Fahren Sie bei WCC < 40 x 106 Zellen/ml mit Schritt 1.1.1 fort; für WCC bei 40 x 106 Zellen/ml mit Schritt 1.1.2 fortfahren. Gießen Sie den Inhalt aller EDTA-Blutröhren in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr und fügen Sie 50 l Human B Cell Enrichment Cocktail pro 1 ml Blut hinzu. Inkubieren Bei Raumtemperatur (RT) für 20 min. Fahren Sie mit Schritt 1.1.2 fort. Verdünnen Sie die Probe im Verhältnis 1:1 mit RT CLL-Waschpuffer (Phosphat-gepufferter Salin (PBS), 0,5% Fetal bovine Serum (FBS) und 2 mM EDTA). Aliquot RT Dichtegradientenmedien in ein entsprechend großes konisches Zentrifugenrohr für die Probe (10 ml in ein 50 ml-Rohr für 30 ml Probe oder 4 ml in ein 15 ml-Rohr für 10 ml Probe). Schichtung der Probe vorsichtig auf die Dichtegradientenmedien und Zentrifuge bei 400 x g für 30 min bei RT.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Zentrifuge bei RT befindet, bevor die Proben in die Zentrifuge gelegt werden, da eine Temperaturänderung zu einer schlechten Anreicherung mononukleärer Zellen führt, und schalten Sie die Bremse an der Zentrifuge aus, da ein plötzliches Bremsen die Flüssigkeitsschnittstelle stören kann. Ernten Sie vorsichtig die weiße Schicht mononukleanischer Zellen, die sich an der Schnittstelle der Dichtegradientenmedien und des CLL-Waschpuffers sammeln, in ein frisches 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr mit einer Pasteur-Kunststoffpipette. Fügen Sie der isolierten Monoschicht 40 ml CLL-Waschpuffer hinzu, um die Zellen und zentrifugen bei 300 x g für 10 min bei RT zu waschen. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie den Boden des Rohres flicken, und wiederholen Sie dann den in Schritt 1.5 beschriebenen Waschschritt. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet wie in Schritt 1.6 beschrieben wieder auf, und setzen Sie das Pellet dann in einem eingestellten Volumen von CLL-Waschpuffer (bis zu 40 ml, abhängig von der Größe des Zellpellets) wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Fahren Sie dann mit der Zytometrie fort, um die Reinheit von CLL-Zellen zu überprüfen.HINWEIS: In diesem Stadium können die CLL-Zellen in einer Konzentration von 10 x 106 Zellen/ml in Medien kultiviert werden, die in Experimenten verwendet werden, und/oder kryopserviert in 10% Dimethylsulfoxid (DMSO)/FBS für zukünftige Arbeiten in Konzentrationen von bis zu 100 x 106 Zellen/Vial. 2. Durchflusszytometrie von CLL-Zellen Etikett 12 mm x 75 mm runde Polystyrolrohre, wie in Tabelle 1beschrieben. In den Röhren 2 – 5 einen Tropfen Kompensationsperlen aufelegen. Fügen Sie 1 L des geeigneten Antikörpers (Anti-CD5, CD19, CD23 oder CD45, wie in Tabelle 1angegeben) zu den Tuben 2 – 5 hinzu und brüten 20 min auf Eis, geschützt vor Licht, indem Sie Zinnfolie über den Eiskübel legen.HINWEIS: Diese Rohre dienen als Kompensationssteuerung für das Einrichten der Durchflusszytometrievorlage. Bis zu 1 x 106 CLL-Zellen in die Röhrchen 1, 6 und 7 geben, 2 ml FACS-Puffer (PBS + 2% FBS) zu jedem Rohr und zentrifugieren bei 300 x g für 5 min bei RT hinzufügen, um die Zellen zu waschen. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Rohre mit Zellpellets auf Eis. Setzen Sie die Zellpellets wieder auf und fügen Sie den Zellen in Tube 7 die entsprechende Kombination von Antikörpern gemäß Tabelle 1in einem Endvolumen von 100 l mit FACS-Puffer hinzu. Antikörper werden in geeigneter Konzentration gemäß den Herstellerrichtlinien eingesetzt. Setzen Sie die Zellpellets in den Röhrchen 2 und 6 in 100 L FACS-Puffer wieder auf. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis, neben den gefärbten Perlen in Röhren 2 – 5, 20 min vor Licht geschützt. Nach der Inkubation 2 ml FACS-Puffer in alle Rohre und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei RT hinzufügen, um die Zellen zu waschen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen-/Zellpellets wieder auf, indem Sie die Rohre sanft flicken. Resuspend Rohre 1 – 5 in 100 L FACS Puffer und legen Sie auf Eis, bis bereit, auf dem Durchflusszytometer zu analysieren. Verdünnen Sie die DAPI-Lösung unmittelbar vor der Verwendung im FACS-Puffer auf 0,05-0,2 g/ml. Die optimale Konzentration kann variieren, und Titration wird empfohlen. Resuspend Rohre 6 und 7 mit 100 l verdünnte DAPI-Lösung und inkubieren die Rohre auf Eis für mindestens 5 min, damit die Zellen färben können.HINWEIS: Eine weitere Waschung ist nicht erforderlich, da DAPI im Puffer vorhanden sein muss, damit abgestorbene Zellen beschriftet bleiben. Sobald DAPI hinzugefügt wurde, müssen Zellen auf dem Durchflusszytometer innerhalb von 4 h analysiert werden. Analysieren Sie Zellen mit einem Durchflusszytometer. 3. Herstellung subzellulärer Brüche aus CLL-Zellen HINWEIS: Bei der Planung des Versuchsaufbaus sollte ein Brunnen aus unstimulierten/unbehandelten Zellen eingeschlossen werden, aus dem der gesamte Zellextrakt erzeugt werden kann. Führen Sie die gewünschte Stimulation und/oder medikamentöse Behandlung der MEC1-CLL-Zelllinie oder isolierter primärer CLL-Zellen mit 10 – 20 x 106 Zellen/Bedingung durch. Zellen werden dann für die subzelluläre Fraktionierung (Schritte 3.4 & 3.5) oder zur Generierung eines ganzen Zellextrakts (Schritt 3.6) verwendet. Vorbereitung von Lösungen/Rohren: Bereiten Sie alle Lösungen/Puffer am Tag der Fraktionierung frisch vor, bevor die Zellen geerntet werden. Bewahren Sie die Lösungen auf Eis auf, bis sie erforderlich sind, und verwenden Sie sie innerhalb von 4 h nach der Zubereitung. PBS/Phosphatase-Inhibitor-Lösung: Bereiten Sie die Phosphatase-Inhibitoren in PBS vor, indem Sie die Phosphatase-Inhibitoren 1:20 in 1x PBS verdünnen (d. h. 0,5 ml Phosphatase-Inhibitoren in 9,5 ml 1x PBS).HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Phosphatase-Inhibitoren nicht gefällt haben. Wenn ein Niederschlag vorhanden ist, 10 min auf 50 °C erhitzen. Hypotonischer Puffer: Bereiten Sie 1x hypotonischen Puffer vor, indem Sie eine 1:10 Verdünnung des 10x hypotonischen Puffers in destilliertem Wasser (d. h. 50 l von 10x hypotonischem Puffer in 450 l dH2O) herstellen. 10 mM Dithiothreitol (DTT): Bereiten Sie 10 mM DTT vor, indem Sie eine 1:100 Verdünnung von 1M DTT mit destilliertem Wasser (d.h. 10 l von 1 M DTT in 990 l dH2O) machen.HINWEIS: DTT ist sehr labil, so bereiten Sie dies frisch jedes Mal. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Tauzyklen. Vollständiger Lysepuffer: Bestimmen Sie, wie viel Puffer für jedes Experiment benötigt wird. Jede Probe benötigt 50 l vollständigen Lysepuffer, also fügen Sie 5 l von 10 mM DTT (Schritt 3.2.3) zu 44,5 l Lysepuffer hinzu und fügen Sie dann 0,5 l Protease-Hemmer-Cocktail hinzu. Dieser Betrag kann je nach Anzahl der Proben im Experiment skaliert werden. Etikettieren Sie vier Sätze von 1,5 ml Mikrofugenröhren für jede Stimulation und/oder medikamentöse Behandlung für die frisch stimulierten Zellen (Schritt 3.3), die frisch erzeugten zytoplasmatischen Fraktionen (Schritt 3.4.3), die frisch erzeugten Kernfraktionen (Schritt 3.5.3) und die ganze Zelle Lysate (Schritt 3.6.3). Diese Mikrofugenröhren auf Eis vorkühlen, bis es erforderlich ist. Übertragen Sie die Zellen in individuell markierte 1,5 ml Mikrofugenrohre und Pellets durch Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml eiskalten PBS/Phosphatase-Inhibitoren wieder aus (Schritt 3.2.1). Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie die Zellpellets auf Eis. Herstellung von zytoplasmatischen Fraktionen: Setzen Sie die Zellpellets, die für die subzelluläre Fraktionierung verwendet werden sollen, vorsichtig in 50 l des 1x hypotonischen Puffers (Schritt 3.2.2) wieder aus. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 15 min, damit die Zellen anschwellen.HINWEIS: Das Volumen des verwendeten hypotonischen Puffers kann empirisch je nach Zellzahl erhöht werden. Fügen Sie 0,8 – 2,5 l (1:20 bis 1:60) Waschmittel in jede Probe und Wirbel auf der höchsten Einstellung für 10 s. Um die optimale Konzentration des Waschmittels für einen bestimmten Zelltyp zu bestimmen, um kerntechnische und zytoplasmatische Fraktionen zu isolieren, führen Sie zunächst einen Waschmittelgradienten durch. Ein Bereich von 1:20 bis 1:60 (d. h. 2,5 l bis 0,8 l Waschmittel in 50 l Hypotonischer Puffer) sollte ausreichend sein.HINWEIS: Wenn das Volumen des hypotonischen Puffers in Schritt 3.4 angepasst wird, stellen Sie sicher, dass das entsprechende Waschmittelverhältnis beibehalten wird. Überprüfen Sie die Zelllyse, indem Sie Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop vor und nach Zugabe von Reinigungsmittel beobachten. Ganze Zellen erscheinen größer mit einem dichten, dunklen Kern. Das Zytoplasma erscheint als heller Halo um den Kern.HINWEIS: Eine angemessene Lyse wird weiterhin durch Western Blotting bestätigt, um bestimmte Proteine innerhalb der lysierten Fraktionen zu analysieren, die aus dem Waschmittelgradienten erzeugt werden. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 30 s bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein vorgekühltes, markiertes Mikrofugenrohr. Diese zytoplasmatische Fraktion kann bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die weitere Analyse erforderlich ist. Das verbleibende Pellet enthält die Kernfraktion (Schritt 3.5).HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Tauzyklen der Proben. Vorbereitung von Kernfraktionen: Setzen Sie jedes Kernpellet in 50 l vollständigen Lysepuffer (Schritt 3.2.4) durch Pipettieren nach oben und unten aus.HINWEIS: Das Volumen des kompletten Lysepuffers kann empirisch an die Startzellenzahl angepasst werden. Fügen Sie 2,5 l Waschmittel hinzu, um Proteine, die mit der Kernmembran verbunden sind, zu löslich und Wirbel auf der höchsten Einstellung für 10 s. Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 30 min. Vortex auf der höchsten Einstellung für 30 s, dann zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein vorgekühltes, markiertes Mikrofugenrohr. Dieser Kernanteil kann bei -80 °C gelagert werden, bis er für die weitere Analyse benötigt wird.HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Tauzyklen der Proben. Vorbereitung ganzer Zelllysate (WCL) aus CLL-ZellenHINWEIS: Die Herstellung des gesamten Zellextrakts kann gleichzeitig mit der Herstellung der Kernfraktionen erfolgen (Schritt 3.5). Setzen Sie die gesamten Zellextrakt-Pellets in 100 l vollständigen Lysepuffer (in Schritt 3.2.4) durch Pipettieren nach oben und unten aus, und fügen Sie dann 5 l Waschmittel hinzu, um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 30 min. Vortex auf der höchsten Einstellung für 30 s, dann zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein vorgekühltes Mikrofugenrohr. Dieses ganze Zelllysat kann bei -80 °C gelagert werden, bis es für die weitere Analyse erforderlich ist.HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Tauzyklen der Proben. 4. Nachgelagerte Analyse subzellulärer Brüche HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Analyse der erzeugten Zellfraktionen durch Western Blotting unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt, die gleiche Zellzahlen/Lane (entspricht 10 g Protein) für kernnukleare und zytoplasmatische Fraktionen geladen. Quantifizierung des Proteinhandels zwischen kerntechnischen und zytoplasmatischen Fraktionen: Führen Sie quantitative Western Blot-Analysen durch Quantifizierung der Signalintensität oder Densitometrie mit frei verfügbarer Western Blot Analysis Software durch. Importieren von Bildern: Westliche Blot-Bilder, die von verschiedenen entwicklungsmittleren Instrumenten generiert werden, müssen als JPG-, PNG- oder TIFF-Dateien importiert werden. Eine RAW-Datei mit 16 Bit Tiefe wird empfohlen. Um ein Bild zu importieren, klicken Sie auf das Softwaresymbol, und bewegen Sie den Mauszeiger über Importieren. Klicken Sie dann auf Bilder von Drittanbietern. Wählen Sie die Bilddatei aus, und klicken Sie auf Öffnen. Anzeigen des Bildes: Klicken Sie im Menüband Bild auf die Schaltfläche Auswählen in der Anzeigegruppe. Das Dialogfeld Anzeige anpassen wird geöffnet, um bei Bedarf weitere Anpassungen zu ermöglichen. Implementieren Sie zusätzliche Verbesserungen wie Helligkeit oder Kontrast mit den einstellbaren Schiebereglern auf der Registerkarte Bild-LUTs. Verwenden Sie die Registerkarte Kurven für feinere Anpassungen. Datenanalyse (Kanalauswahl): Klicken Sie auf das Menüband Analyse. Um nur einen Kanal zu analysieren, deaktivieren Sie die Nicht-Analyse der Kanäle. Klicken Sie in den Bild-LUTs auf die Miniaturansicht “Kanal nicht anzeigen” eines Kanals, sodass nur der gewünschte Kanal angezeigt wird. Bilder, die als JPG-, PNG- oder TIFF-Dateien importiert werden, erfordern möglicherweise die Deauswahl mehrerer unerwünschter RGB-Kanäle. Hinzufügen von Formen: Um die Signalintensität zu quantifizieren, klicken Sie auf Rechteck hinzufügen, um dem Bild ein Rechteck hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Mitte eines Features (z. B. ein Proteinband), um ein Rechteck um das Feature zu legen. Alternativ können Sie eine Form manuell zeichnen, und wählen Sie Rechteck zeichnen. Nachdem Sie alle gewünschten Shapes hinzugefügt haben, klicken Sie auf Auswählen, um den Cursor zum Auswahlwerkzeug zurückzukehren.HINWEIS: Fügen Sie mehrere Shapes in logischer Reihenfolge hinzu, da die Daten nach einer ID-Nummer sortiert werden, die sequenziell generiert wird. Hintergrundsubtraktion: Um Hintergrundgeräusche zu subtrahieren, klicken Sie auf die erste Schaltfläche in der Hintergrundgruppe, und wählen Sie median aus dem Dropdown-Menü aus. Legen Sie die Rahmenbreite im Hintergrunddialog auf 3 fest, und wählen Sie die Segmente aus, die für die Hintergrundberechnung verwendet werden sollen. Wählen Sie bei der Auswahl der zu verwendenden Segmente Segmente aus, die den Bildhintergrund am besten darstellen.HINWEIS: Hintergrundrauschen kann die Signalquantifizierung beeinflussen, daher muss es subtrahiert werden, um das Signal von den Formen des Interesses genau zu berechnen. Trimmsignal und Trimmhintergrund – OPTIONAL: Dateien, die in JPG-, PNG- oder TIFF-Formaten importiert werden, können eine Pixelsättigung aufweisen: hervorgehobene/helle Bereiche innerhalb eines Proteinbandes. Trimmsignal und Trimmhintergrund (Bkgnd) entfernt gesättigte Pixel aus der Analyse. Um diese Werte anzuzeigen, fügen Sie Trim Signal und Trim Bkgnd zu einer Tabelle hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Spalten rechts in der Tabellenansicht klicken.HINWEIS: Die Pixelsättigung kann zu einer unzuverlässigen Quantifizierung führen. Gesättigte Pixel können nur entfernt werden, wenn weniger als 5 % der Pixel innerhalb einer Form gesättigt sind. Exportdaten: Klicken Sie auf die Registerkarte Shapes über der Tabelle. Für die Densitometrie sind Werte in der Signalspalte erforderlich. Signal ist die Summe der Pixelintensitätswerte (Gesamt) für eine Form abzüglich des Produkts des Bkgnd und des Bereichs. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht. Klicken Sie auf Speichern unter oder Starten der Kalkulationstabelle.Signal = Gesamt – (Bkgnd x Area)HINWEIS: Die Registerkarte Shapes enthält eine Tabelle mit quantitativen Werten, einschließlich Signal, Total, Area und Bkgrnd. Quantifizierung der Proteinexpression: Berechnen Sie in der gespeicherten Tabelle die normalisierte Expression des Proteins von Interesse für jede Lane oder Variable, indem Sie das erhaltene Signal für das Protein von Interesse durch das Signal für das entsprechende Proteinladekontrollband dividieren.HINWEIS: Vergleiche zwischen den Mengen eines normalisierten Proteins von Interesse über Kern- und Zytoplasmafraktionen können aufgrund der unterschiedlichen Belastungskontrollen zur Unterscheidung von Kern- und Zytoplasmafraktionen nicht direkt verglichen werden. Es sind jedoch Vergleiche innerhalb einzelner Fraktionen, z.B. nach medikamentöser Behandlung, angebracht. Bild für die Veröffentlichung oder Präsentation exportieren: Klicken Sie auf die Registerkarte Bilder, die sich über der Tabelle befindet, und klicken Sie dann auf das zu exportierende Bild. Wenn Sie das Bild für eine Diapräsentation oder andere digitale Formate verwenden, klicken Sie auf das Softwaresymbol, bewegen Sie den Mauszeiger über Exportieren und klicken Sie auf Bild für digitale Medien. Speichern Sie das Bild nach Bedarf als JPG-, PNG- oder TIFF-Datei.

Representative Results

Bei der Planung von Experimenten an primären CLL-Zellen, wenn Assays eine große Anzahl von Zellen erfordern (>50 x 106 Zellen), wird die Verwendung frisch isolierter CLL-Zellen anstelle von kryokonservierten Zellen bevorzugt, die auftauen müssen, dies ist jedoch nicht immer möglich. Dies liegt daran, dass der Freeze/Tau-Prozess zum Tod von bis zu 50% der CLL-Zellen führen kann, obwohl dies stichprobenabhängig ist. Anreicherung von CLL-Zellen mit einem WCC >40 x 106/ml mittels Dichtezentrifugation, wie hier beschrieben (Schritte 1.3 – 1.5) ermöglicht eine hohe Zellwiederherstellung mit hoher Reinheit (ca. 95%) primäre CLL-Zellen. In der gezeigten Probe wurde der WCC = 177 x 106/ml: aus einer 30 ml Blutprobe 5 x 109 Zellen gewonnen, was eine Zellausbeute von 94% der Gesamtzellen darstellt. Die Analyse dieser Probe durch Durchflusszytometrie ergab eine Reinheit der CLL-Zellen von >95%, wie die doppelflächende Expression der CLL-Zellmarker CD19 und CD5 nach dem Gating auf FSC/SSC, Einzelzellen, die DAPI-negativ waren (lebensfähige Zellen) (Abbildung 1). Die Optimierung des subzellulären Fraktionierungsverfahrens wurde mit einem Bereich von Waschmittelverhältnissen (1:20 bis 1:60) während der Herstellung der zytoplasmatischen Fraktion (Schritt 3.4) durchgeführt. Danach wurden die Kernfraktionen und WCLs vorbereitet (Schritte 3.5 bzw. 3.6). Immunoblots wurden an den resultierenden Fraktionen der CLL-Zelllinie MEC1 (Abbildung 2A) und der primären CLL-Zellen (Abbildung 2B) durchgeführt. Die Flecken wurden für die Bruchmarker Lamin A/C (kerniv; 74/63 kDa) und Stubulin (zytoplasmatisch; 55 kDa) untersucht, um eine erfolgreiche Zellfraktionierung zu bestätigen. Die Fraktionierung gibt an, dass der optimale Waschmittelspiegel für MEC1-Zellen eine Verdünnung von 1:60 ist (Abbildung 2A), verglichen mit einer 1:30-Verdünnung, die für primäre CLL-Zellen optimal ist (Abbildung 2B), wie durch eine Anreicherung von Kernprotein und ein Mangel an zytoplasmatischem Protein in den Fraktionen und umgekehrt. WCLs stellen das gesamte Protein dar und wirken als positive Kontrolle für Antikörper, die zum Untersuchen der subzellulären Fraktionen verwendet werden. Es ist wichtig, geeignete Proteine als Bruchmarker zu wählen: Abbildung 2C zeigt Immunoblots von Kern-/Zytoplasma-Fraktionen, die aus MEC1-Zellen hergestellt wurden, in denen RNA-Polymerase II (Rpb1 CTD; 250 kDa) und Lamin A/C als Marker Kernfraktionen, während als zytoplasmatische Marker die Kernfraktionen , während die Stubulin- und die S-Tubulin(50 kDa) verwendet wurden. Es ist klar, dass das Tubulin im Zytoplasma angereichert ist, aber die Expression ist im Zellkern offensichtlich, wie zuvorgezeigt 9. Sobald die experimentellen Bedingungen optimiert sind, kann ein Experiment durchgeführt werden. In den gezeigten Beispielen wurde die subzelluläre Lokalisation von FOXO1 in kern- und zytoplasmatischen Fraktionen bei Stimulation von Zellen mit dem B-Zell-Antigenrezeptor (BCR) in Gegenwart oder Abwesenheit des Dual-MTORC1-Hemmers AZD8055 in MEC1-Zellen bestimmt ( Abbildung 3A) und primäre CLL-Zellen ( Abbildung3B)5,10. In beiden Beispielen wurde die Erzeugung hoch angereicherter Kern- und Zytoplasmafraktionen erreicht, wie die fast ausschließliche Expression von Lamin in der Kernfraktion und der Tubulin-Gruppe in den zytoplasmatischen Fraktionen zeigt. In beiden Zelltypen wurde die FOXO1-Expression im Zytoplasma nach der Behandlung mit AZD8055 im Vergleich zu NDC reduziert, begleitet von einer Erhöhung der FOXO1-Expression im Kernkompartiment, wodurch die Proteintranslokation nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Um die Subjektivität der Dateninterpretation zu beseitigen, wurden einzelne Immunoblots aus fünf primären CLL-Proben innerhalb subzellulärer Fraktionen quantifiziert (Schritt 4; Abbildung 4A), wobei die jeweiligen kerntechnischen oder zytoplasmatischen Proteine als interne Belastungskontrollen für jede Probe verwendet werden und dann jede Fraktion auf die nicht stimulierte (US) keine Arzneimittelkontrolle (NDC) normalisiert wird, wie angegeben. Die resultierende Grafik zeigt Trends der FOXO1-Bewegung zwischen den kerntechnischen und zytoplasmatischen Fraktionen, wobei AZD8055 die FOXO1-Expression im Zytoplasma reduziert und gleichzeitig die Expression im Zellkern erhöht. Darüber hinaus ist eine Erhöhung der zytoplasmischen FOXO1-Expression bei BCR-Vernetzung erkennbar. Tube Tube Name Zellen/Perlen Antigen Fluorophor 1 Unstained Zellen Na Na 2 Single Stain Perlen CD5 Fitc 3 Single Stain Perlen CD19 PE-Cy7 4 Single Stain Perlen CD23 Apc 5 Single Stain Perlen CD45 APC-Cy7 6 Single Stain Zellen durchführbarkeit Dapi 7 CLL Fleck Zellen CD5, CD19, CD23, CD45 & Lebensfähigkeit FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 & DAPI Tabelle 1: Tabelle mit dem idealen Satz von Probenröhrchen, die für die Durchflusszytometrie von CLL-Zellen erforderlich sind. Jedes Experiment muss alle geeigneten Kontrollen für eine genaue Analyse der erzielten Ergebnisse enthalten. Abbildung 1: Repräsentatives Analysediagramm der Durchflusszytometrie von angereicherten CLL-Patienten. Mononukleäre-CLL-Zellen, die aus dem peripheren Blut eines einzelnen CLL-Patienten angereichert wurden, wurden mit FSC-A vs. SSC-A abgezäutt, und Doublets wurden dann mit FSC-A vs. FSC-H (A) ausgeschlossen. Unbefleckte Zellen (Röhre 1) und Kompensationskontrollen (Röhren 2-6) wurden verwendet, um das Durchflusszytometer einzurichten, um Zellen zu erkennen und zwischen den Fluoreszenzkanälen zu kompensieren, wodurch sichergestellt wurde, dass die Fluoreszenzsignale korrekt erkannt wurden. (B) Ein Beispiel für negative Färbung (ungefärbte Zellen; Röhre 1) in den Fluoreszenzkanälen CD19 und CD5. Live (DAPI-negativ) und CD45-positive Zellen wurden abgegrenzt (C) und der Anteil von CD19+CD5+ (95,5%) und CD19+CD23+ (91,2%) Zellen innerhalb der DAPI-CD45+ Population wurde bestimmt (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Optimierung der kern-/zytoplasmatischen Fraktionierung. Zytoplasmatische und kernnukleare Fraktionen sowie ganze Zelllysate (WCL) wurden aus Zellpellets (10 – 20 x 106 Zellen) der CLL-Zelllinie (A) MEC1 oder (B) primärer CLL-Zellen hergestellt, die aus dem peripheren Blut von Patienten angereichert wurden, wie in Schritt 3. Die Optimierung der subzellulären Fraktionierung wurde mit einem Bereich von Waschmittelverhältnissen (1:20 bis 1:60) bei der Herstellung der zytoplasmatischen Fraktion (wie in Schritt 3.4 beschrieben) durchgeführt. Die resultierenden Proben wurden immunoblotted und mit Anti-Lamin A/C (Kern) und Anti–Tubulin (zytoplasmatischen) Antikörpern untersucht, um eine erfolgreiche Zellfraktionierung neben WCL zu bestätigen. Molekulargewichtsmarker werden links vom Fleck (M )angezeigt. * zeigt die optimalen Waschmittelbedingungen für die Zelllyse an. (C) Immunoblot von kerntechnischen und zytoplasmatischen Fraktionen aus MEC1-Zellen mit Kontrollbedingungen (NDC) oder medikamentöser Behandlung (8055) in Gegenwart fehlender Stimulation (+ bzw. – BCR-Vernetzung). Blots wurden mit Anti-Rbp1 CTD (Klon 4H8; Erkennung von RNA-Polymerase II Untereinheit B1), Anti-Lamin A/C, Anti-A-Tubulin oder Anti-A-Tubulin (Klon GTU-88) Antikörper untersucht, um subzelluläre Fraktionen zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Die subzelluläre Fraktionierung zeigt die Abschaltung von FOXO1 zwischen dem Kern und dem Zytoplasma in CLL. (A) MEC-1-Zellen und (B) primäre CLL-Zellen wurden 30 min lang mit 100 nM AZD8055 (8055) vorbehandelt oder unbehandelt (NDC) wie angegeben und dann BCR für 1 h ligiert oder us verlassen. Anschließend wurden kerntechnische und zytoplasmatische Fraktionen hergestellt und immunoblotted. Nach Bestätigung der Fraktionierung durch Sondierung mit Anti-Lamin A/C (Kern) und Anti-A-Tubulin (zytoplasmatische) Antikörper, wurde die Wirkung sowohl der medikamentösen Behandlung als auch der BCR-Ligation auf die FOXO1-Proteinexpression mit einem Anti-FOXO1-Antikörper bewertet. M zeigt molekulare Gewichtsmarker an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Ein bearbeitetes Beispiel für die quantitative Western-Blot-Analyse (Densitometrie). (A) Densitometrie wurde mit Western Blot Analysis Software online verfügbar durchgeführt. Kurz gesagt, innerhalb des Analysis-Menüs wurden Rechtecke um Proteinbänder im Bild gezeichnet, um die Signalintensität zu berechnen. Dargestellt ist die Densitometrie eines repräsentativen westlichen Blotbildes einer CLL-Patientenprobe, die einer zytoplasmischen/nuklearen Fraktionierung unterzogen wurde. Zytoplasma- und Kernfraktionen unterscheiden sich durch die Expression von zytoplasmischen (-tubulin) und nuklearen (Lamin A/C) Markern. Die normalisierte Expression von FOXO1 für eine gegebene Bedingung kann berechnet werden, indem das für FOXO1 erhaltene Signal durch das entsprechende Signal für s-Tubulin oder Lamin A/C dividiert wird, abhängig von der analysierten Fraktion. Der relative FOXO1-Ausdruck (relativ zur US-Fahrzeugsteuerung) kann berechnet werden, indem der normalisierte FOXO1-Ausdruck einer bestimmten Bedingung durch den normalisierten FOXO1-Ausdruck der US-Fahrzeugsteuerung eines bestimmten Zellanteils dividiert wird. (B) Diagramm, das die FOXO1-Expressionsniveaus in den zytoplasmischen (links) oder nuklearen (rechts) Fraktionen zeigt, normalisiert sich zu US-NDC-Kontrolle innerhalb jeder zellulären Fraktion. Der rote Punkt im Diagramm ist das gezeigte Beispiel. Diese Daten zeigen die durchschnittliche Faltungsänderung des FOXO1-Ausdrucks im Vergleich zu US-NDC – SEM. P-Werte wurden durch zweischwänzige Students paired t Test bestimmt. n = 5 individuelle CLL-Patientenproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das beschriebene Protokoll bietet eine schnelle und effiziente Methode zur Erzeugung von kern- und zytoplasmatischen Fraktionen aus primären CLL-Zellen und einer anschließenden Quantifizierung des Proteinhandels zwischen kern- und zytoplasmatischen Fraktionen bei Zellstimulation. und medikamentöse Behandlung. Die vorgelegten Daten zeigen die Fähigkeit, den Handel mit bestimmten Proteinen, z. B. FOXO1, zwischen den kernnuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen bei Behandlung mit einem Dual-MTOR-Hemmer AZD8055 bei Vorhandensein/Abwesenheit von BCR-Vernetzung durch F( ab’)₂ Fragmentstimulation (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Kopplung dieser Experimente mit der Quantifizierung westlicher Flecken aus einzelnen CLL-Patientenproben ermöglicht objektive Analysen der erzeugten Daten und zeigt die Robustheit des beschriebenen Assays zur Quantifizierung globaler Veränderungen der Proteinlokalisierung in CLL-Zellen, die aus Patientenkohorten isoliert sind (Abbildung 4). Aus den Daten geht hervor, dass durchschnittlich fünf Patientenproben in den zytoplasmatischen Fraktionen nahe an Bedeutung gelangt sind. Angesichts der klinischen Heterogenität von CLL-Patienten¹¹würden diese Analysen normalerweise an größeren Patientenkohorten durchgeführt und/oder sich auf spezifische prognostische Untergruppen von Patienten konzentrieren, um ein umfassenderes Verständnis des zellulären Ansprechens von CLL zu erlangen. Zellen zu spezifischen medikamentösen Behandlungen.

Die vorgestellten Daten zeigen, wie wichtig es ist, Proteinmarker auszuwählen, die sich ausschließlich in den zytoplasmatischen oder nuklearen Fraktionen befinden, da die Reinheit der Fraktionierung durch diese Marker bestätigt wird. Für die Bestätigung der zytoplasmatischen Fraktion und Lamin A/C als Kernmarker wurde das Unternehmen für die Zytoplasma-Fraktion-Bestätigung ausgewählt. Weitere Proteine, die häufig verwendet werden, sind GAPDH und ‘-Tubulin zur Identifizierung der zytoplasmatischen Fraktion oder Brg1 (SMARCA4), TFIID und RNA Polymerase II für die Kernfraktion Reinheit⁴^,⁵. Bei der Auswahl von Proteinen, die in bestimmten Fraktionen hoch angereichert sind und nicht in beiden Fraktionen (z.B. Tubulin)(Abbildung 2C)⁹vorhanden sind, ist jedoch Vorsicht geboten. Tatsächlich können GAPDH und Actin, obwohl sie allgemein als zytoplasmatische Proteine betrachtet werden, auf den Kern¹²^,¹³lokalisieren, was die Bedeutung der Wahl eines Fraktionsmarkers unterstreicht, der sich nicht verlagert, wenn stimulationoder behandlung auf die Zellen angewendet werden. Darüber hinaus ist es wichtig zu bestätigen, dass der gewählte Proteinmarker in der Voninteresse entosenden Zelle ausgedrückt wird, indem die WCL neben den subzellulären Fraktionen ausgeführt wird.

In dem gezeigten repräsentativen Experiment wurde für jede Erkrankung die gleiche Anzahl von CLL-Zellen verwendet (Stimulation/Drogenbehandlung), und danach wurden die Fraktionierungsproben sofort vorbereitet. Das Beladen von 10 g fraktioniertem Protein/Lane liefert ausreichend Material für die Detektion der proteine von Interesse. Da diese Proben nur einer kurzfristigen medikamentösen Behandlung und Stimulation (bis zu 4 h) unterzogen wurden, wurde angenommen, dass der Proteinspiegel in jeder Probe gleich bleiben würde und kein Proteintest durchgeführt wurde. Wenn jedoch die Zellbehandlungen verlängert werden (18 – 72 h), kann der Grad des Zelltodes oder der Zellproliferation in den Zellen die Qualität und Quantität des extrahierten Proteins erheblich verändern, abhängig von der anwendung Arzneimittel-/Zellstimulation, wodurch sich der Proteinspiegel in der behandelten /stimulierte Proben. In diesen Fällen für längerfristige medikamentöse Behandlungen ist es ratsam, proteinquantifizierbar mit einem Bradford-Assay oder einem Äquivalent durchzuführen, bevor Western Blotting die gleiche Menge an Protein in jeder Spur des Immunoblots abläuft. Das Vorhandensein von Detergenzien kann mit spezifischen Protein-Assays¹⁴stören, diese Interferenz kann durch Verdünnung von Zellfraktionsproteinproben reduziert werden. Verwenden Sie außerdem den vollständigen Lysepuffer als Rohling, wobei die gleiche Verdünnung wie in den getesteten Proben verwendet wird.

Um belegliche Beweise für die hier beschriebenen Befunde zu liefern, könnten parallele Experimente mit Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um die Position von FOXO1 in CLL-Zellen zu analysieren, um eine Visualisierung dieser Ergebnisse zu ermöglichen⁵. Darüber hinaus können die erzeugten subzellulären Fraktionen auch für Enzymaktivitäts-Assays oder Proteomik-Analysen in weiteren nachgelagerten Analysen verwendet werden.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Natasha Malik für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Diese Studie wurde durch ein Bloodwise-Projektstipendium an AMM (18003) finanziert. FACS-Analyseeinrichtungen wurden von der Howat Foundation finanziert. MWM wurde durch eine Doktorandschaft des Friends of Paul O’Gorman Leukaemia Research Centre, JC wurde vom Friends of Paul O’Gorman Leukaemia Research Centre und JH durch ein Bloodwise-Projektstipendium (18003) finanziert.

Materials

1.5 mL microcentrifuge Tubes	Griener Bio one	616201
3 mL Pasteur Pipettes	Griener Bio one	612398
12 mm x 75 mm FACS Tubes	Elkay	2052-004
15 mL Tube	Griener Bio one	188271
50 mL Tube	Griener Bio one	227261
anti-CD5 FITC antibody	BD Biosciences	555352	phenotypic surface marker
anti-CD19 PE Cy7 antibody	BD Biosciences	557835	phenotypic surface marker
anti-CD23 APC antibody	BD Biosciences	558690	phenotypic surface marker
anti-CD45 APC Cy7 antibody	BD Biosciences	557833	phenotypic surface marker
anti-β-Tubulin antibody	Cell Signaling	2146	cytoplasmic marker
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T5326
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody	Cell Signaling	2880
anti-Lamin A/C antibody	Cell Signaling	2032	nuclear marker
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7076	Secondary antibody
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074	Secondary antibody
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8)	Cell Signaling	2629	nuclear marker
BDFACS Canto II	BD Biosciences	By Request	Flow Cytometer
DAPI Solution	BD Biosciences	564907	live/dead discriminator
DMSO	Sigma	D2650
EDTA	Sigma	EDS
Fetal Bovine Serum	Thermofisher	10500064
GraphPad Prism 6	GraphPad Software		Software
Histopaque1077 density gradient media	Sigma	H8889
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker	Bioline	BIO-33066	Molecular weight marker
Image Studio Lite (version 5.2.5)	LI-COR	www.licor.com	Software
Labnet VX100	Fisher Scientific		Vortex
Nucelar Extract Kit	Active Motif	40010
OneComp eBeads	Thermofisher	01-111-42
Trypan Blue Solution	Thermofisher	15250061
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26619	Molecular weight marker
PBS Tablets	Fisher Scientific	BR0014G
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15064
Sigma 3-16P	SciQuip		Centrifuge
Sigma 1-15PK	SciQuip		Centrifuge

Referanslar

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Subcellular Fractionation Chronic Lymphocytic Leukemia Nuclear/cytoplasmic Protein Trafficking Tumor Suppressor Proteins Pathogenesis B Cell Malignancies Protein Localization Protein Movement Density Gradient Centrifugation Mononuclear Cells

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Hay, J., Moles, M. W., Cassels, J., Michie, A. M. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. Vis. Exp. (152), e60426, doi:10.3791/60426 (2019).