Medir taxas de mutação microbiana com o ensaio de flutuação
Özet
Aqui, um protocolo é apresentado para realizar um ensaio de flutuação e estimar a taxa de mutação microbiana usando marcadores phenotípicos. Este protocolo permitirá aos pesquisadores analisar mutações em diversos micróbios e ambientes, determinando como o genótipo e o contexto ecológico afetam as taxas de mutação espontânea.
Abstract
Os ensaios de flutuação são amplamente utilizados para estimar as taxas de mutação em micróbios que crescem em ambientes líquidos. Muitas culturas são cada inoculadas com alguns milhares de células, cada uma sensível a um marcador seletivo que pode ser ensaiou fenotipicamente. Essas culturas paralelas crescem por muitas gerações na ausência do marcador phenotípico. Um subconjunto de culturas é usado para estimar o número total de células em risco de mutações (ou seja, o tamanho da população no final do período de crescimento, ou Nt). As culturas restantes são banhadas no ágar seletivo. A distribuição de mutantes resistentes observados entre culturas paralelas é então usada para estimar o número esperado de eventos mutacionais, m,usando um modelo matemático. Dividir m por Nt dá a estimativa da taxa de mutação por locus por geração. O ensaio tem três aspectos críticos: o marcador phenotípico escolhido, o volume escolhido de culturas paralelas e garantir que a superfície no ágar seletivo esteja completamente seca antes da incubação. O ensaio é relativamente barato e só precisa de equipamentos laboratoriais padrão. Também é menos trabalhoso do que abordagens alternativas, como acúmulo de mutação e ensaios unicelulares. O ensaio funciona em organismos que passam por muitas gerações rapidamente e depende de suposições sobre os efeitos da aptidão dos marcadores e morte celular. No entanto, ferramentas recentemente desenvolvidas e estudos teóricos significam que essas questões agora podem ser abordadas analiticamente. O ensaio permite a estimativa da taxa de mutação de diferentes marcadores de pernotiópico em células com diferentes genótipos crescendo isoladamente ou em uma comunidade. Ao realizar vários ensaios em paralelo, os ensaios podem ser usados para estudar como o contexto ambiental de um organismo afeta a taxa de mutação espontânea, que é crucial para a compreensão da resistência antimicrobiana, carcinogênese, envelhecimento e evolução.
Introduction
Em 1901, o botânico holandês Hugo de Vries cunhou o termo mutação1. Vinte e seis anos depois, quando Hermann Joseph Muller descobriu a ação mutagênica dos raios-X2,as mutações já eram percebidas como uma das forças motrizes da evolução. Entretanto, a natureza das mutações não era desobstruída. Para responder à questão fundamental de saber se as mutações emergem espontaneamente (ou seja, uma mutação espontânea) ou em resposta à seleção (ou seja, uma mutação induzida), um método era necessário para observar eventos mutacionais. Tal método mediria o número esperado de mutações por divisão celular ou o que já era conhecido como uma taxa de mutação3,4.
Figura 1: Ilustração esquemática de como executar o ensaio da flutuação com uma tensão microbiana em uma placa profunda do poço de 96. A) Inocular e acclimator células em tubos de 50 mL contendo cinco ambientes diferentes (‘vermelho’, ‘azul’, ‘verde’, ‘roxo’, e ‘laranja’ ensaios). (B)Prepare culturas paralelas com um pequeno número de células sensíveis em uma placa de poço de 96 profundidade. O ensaio “vermelho” tem 20 culturas paralelas, enquanto o ‘azul’, ‘verde’, ‘roxo’ e ‘laranja’ ensaios todos têm 19 culturas paralelas. As posições das culturas paralelas na placa de poço profundo 96 são aleatórias. A randomização pode ser feita com o script LayoutGenerator.R suplementar ou por alguma outra ferramenta. O layout no canto superior direito é o resultado da randomização. Incubaçãoda placa de 96 poços profundos e permitir que as células se dividam e se transformem espontaneamente. Seis culturas de poços profundos A1, B1, C1, E1, F1 e G1 mostram como o número de mutantes flutua: 4, 0, 2, 2, 1 e 4 células vermelhas após a terceira divisão celular, respectivamente. O número de mutantes difere não só por causa do número diferente de mutações espontâneas (0, 1 ou 2, como mostrado pela primeira célula vermelha), mas também porque é importante quando durante um ciclo de cultura uma mutação de resistência emerge espontaneamente (divisão celular 1, 2 ou 3). (D)Após a incubação da placa de poço profundo 96 o número de mutantes é determinado por revestimento 81 culturas paralelas. No layout estes são círculos sem bordas ousadas. Toda a cultura paralela é banhada em um poço de uma placa de 6 poços contendo um ágar seletivo. (E)As 15 culturas restantes são diluídas e banhadas na ágar não seletiva para determinar o número médio de células(Nt). No layout estes são rotulados como Ntwells e têm bordas ousadas. Para cada ensaio Nt é em média mais de três culturas paralelas. Na parte inferior direita é uma placa de Petri contendo uma placa de ágar não-seletiva com 25 CFUs de uma cultura diluída cultivada em um poço profundo D1 (parte de um ensaio “verde”). (F)Após a incubação das placas seletivas de 6 poços o número de mutantes observados foi contado e o número esperado de eventos mutacionais, m,foi estimado usando um estim máximo do likelihoodador. Conhecendotanto o número de mutações, m,quanto o número de células por ensaio, Nt,a taxa de mutação foi estimada como m/Nt. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Salvador Luria e Max Delbrück, em 1943, forneceram uma solução engenhosa para este problema com o ensaio de flutuação5 (ver Figura 1). O ensaio começa com múltiplas populações (chamadas culturas paralelas) que são iniciadas com um pequeno número de células microbianas (Figura 1A,B). Após o crescimento em um ambiente benigno e não seletivo (Figura 1C),culturas paralelas são transferidas em placas contendo um marcador seletivo (fagos, antibióticos, etc.), onde apenas células com mutação de resistência sobrevivem e podem produzir uma colônia (Figura 1D). A expectativa principal era que se as mutações da resistência são induzidas, o número de pilhas que carreg uma mutação deve ser distribuído entre populações diferentes com o meio igual à variação. O que Luria e Delbrück encontraram com o ensaio de flutuação é que o número de mutantes flutuou drasticamente e que a variação no número de mutantes entre diferentes populações era consideravelmente maior do que a média. Luria e Delbrück demonstraram assim que as mutações são espontâneas. Eles mostraram que mutações surgem espontaneamente sempre que o DNA é replicado, e o número de mutantes depende de quando a mutação ocorre durante o crescimento da população. Veja a Figura 1C,onde seis populações, cada uma iniciada com uma célula microbiana (em azul), experimentam nenhuma, 1 ou 2 mutações únicas. As populações A1, E1 e F1 experimentaram uma única mutação (primeira célula vermelha), mas como uma única mutação surge espontaneamente em vários momentos durante um ciclo cultural, as populações acabaram com um número muito diferente de mutantes observados (quatro, dois e um, respectivamente). Por outro lado, as populações C1 e G1 acabaram com o mesmo número de mutantes observados como E1 e A1, apesar de experimentar dois eventos mutacionais em vez de um. A flutuação dos mutantes observados entre as populações não só deu o alvo o nome, mas também mostrou que uma freqüência mutante (ou seja, a proporção de células mutantes) é um indicador inadequado da taxa de mutação.
O objetivo geral do ensaio de flutuação é estimar a taxa de mutação espontânea de um genótipo específico de bactérias ou outro organismo unicelular que cresce em um ambiente líquido específico. O ensaio de flutuação continua a ser a ferramenta mais adequada para estudar a dependência ambiental das taxas de mutação microbiana e permite a estimativa rápida e barata da taxa de mutação. Abordagens alternativas à estimativa da taxa de mutação, como sequenciamento de profundidade máxima6,sequenciamento populacional7,experimentos de acumulação de mutação8,ou comparando sequências genômicas de uma prole com as dos pais9 são muito mais trabalhosas e, portanto, pouco adequadas para detectar potencialmente dependências ambientais. No entanto, aspectos dinâmicos da geração e reparo de uma mutação são em grande parte inacessíveis a um ensaio de flutuação ou a qualquer um dos métodos de atribuir uma taxa de mutação listada acima. Para estudar como o número de mutações muda no tempo, espaço ou entre células individuais dentro de uma população, são necessárias abordagens de células únicas11,12, o que, além de ser mais trabalhoso do que ensaios de flutuação, requer habilidades e equipamentos altamente especializados.
Na prática, um ensaio de flutuação é contar as células ganhando um marcador phenotípico devido a uma mutação que ocorre em um ambiente sem seleção para esse marcador. A meta-análise de centenas de ensaios publicados10 mostra que pelo menos 39 marcadores pofogóricos diferentes têm sido usados desde o início do ensaio em 1943. O ensaio de flutuação pode ser usado para comparar médias e dependência ambiental das taxas de mutação entre cepas laboratoriais, clínicas, não-mutantes e mutadorais que crescem em ambientes permissivos. O ensaio permite a estimativa da taxa de mutação em células com diferentes origens genéticas crescendo em ambientes mínimos ou ricos. O ensaio é adequado não só para as populações que crescem como uma monocultura, mas também pode ser usado para estudar os efeitos das interações célula-célula sobre as taxas de mutação11. Quando a tensão do interesse é cocultured com uma segunda tensão, e um marcador neutro é usado para distinguir as tensões, as taxas da mutação podem ser avaliadas para duas tensões no mesmo tubo ao mesmo tempo.
Os ensaios da flutuação revelaram que a taxa espontânea da mutação depende em cima do genótipo de uma pilha e de seu ambiente12 e é um traço que próprio evolua13. Sempre que a taxa de mutação de um genótipo específico muda com o ambiente, é descrita como plasticidade de taxa de mutação11. As taxas de mutação plástica foram mais bem abordadas para mutagênese induzida pelo estresse (SIM)14. Além disso, usando ensaios de flutuação, tem sido recentemente demonstrado que a densidade a que uma população de células cresce (normalmente uma cultura de lote na capacidade de transporte) está intimamente associada com as taxas de mutação em bactérias e eucariontes unicelulares. A taxa de mutação por genoma por geração diminui em populações densas em até 23 vezes10,11. Esta plasticidade de taxa de mutação associada à densidade (DAMP) pode depender de um sistema de detecção de quórum15 e agir independentemente do SIM16.
Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o ensaio de flutuação usado para estudar cepa escherichia coli K-12 ganhando resistência ao antibiótico rifampicin em um ambiente de mídia mínima de glicose. No entanto, este protocolo deve ser visto como um modelo básico que pode ser utilizado para estudar uma grande variedade de micróbios, simplesmente modificando as condições de cultura e marcadores phenotípicos da mutação. O protocolo evoluiu desde a sua criação5,17,18,19,20, 21,22,23, 24,25,26,27,29, 29, através de seu uso em uma ampla gama de micróbios e até mesmo células cancerosas30 e foi modificado para aumentar a taxa de taxas de veio, que foi essencial para testar adequadamente as dependências ambientais das taxasdemutação microbiana10,11,16. O protocolo aqui descrito não abrange todas as questões metodológicas e analíticas do ensaio de flutuação que já foram bem discutidos na literatura, particularmente os efeitos da aptidão de mutações resistentes31, atraso phenotípico32, morte celular33, ea adequação de vários algoritmos disponíveis para estimar as taxas de mutação26,34. Isso pode ser importante, por exemplo, quando a dependência ambiental dos efeitos da aptidão pode dar origem a variação errônea na taxa de mutação estima35. No entanto, notamos que as ferramentas analíticas que usamos aqui podem lidar com a variação na aptidão mutante e morte celular. Como abordado nas notas e discussão, também é recomendável que vários marcadores de phenotípico que são improváveis de ter os mesmos efeitos de aptidão ambientalmente dependentes ser considerado. Este protocolo permitirá que as pessoas rotineiramente para analisar as dependências ambientais das taxas de mutação na diversidade de cepas microbianas e ambientes. Assumos mutações em diferentes ambientes ainda não foram completamente testadas e uma vez considerada a densidade populacional, os ensaios de flutuação podem dar uma estimativa mais precisa da taxa de mutação10. Este protocolo permitirá a realização de mais ensaios de flutuação, como é necessário para a compreensão dos mecanismos subjacentes às taxas de mutação, que por sua vez são vitais para a compreensão da evolução, da carcinogênese, do envelhecimento e da resistência antimicrobiana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qualquer estimativa de uma taxa de mutação precisa maximizar a precisão alcançada para garantir a repetibilidade e reprodutibilidade dentro e entre os estudos34. Para um ensaio de flutuação, há três considerações críticas. Os dois primeiros foram definidos no protocolo dado, mas vai precisar de solução de problemas (ver Figura 3)se o protocolo é adaptado para trabalhar com diferentes cepas ou ambientes. Primeiro é escolher o marcador phenotípico apropriado. Para as bactérias, recomenda-se estimar taxas em um dos dois marcadores loci, rpoB ou gyrA, conferindo resistência aos antibióticos rifampicin a ácido nalidixic, respectivamente. O tamanho alvo de mutações à resistência aos antibióticos nestes dois loci é diferente. Existem 79 e 20 mutações únicas que conferem resistência à rifampicina37 e ácido nalidixic40, respectivamente. Na prática, isso significa que, em média, os mutantes resistentes à rifampicina são observados com mais frequência. Assim, a primeira pergunta (Q1 na Figura 3) que precisa ser respondida é se a cepa é ou não um mutator. Quando os mutadores constitutivos são estudados, onde muitas colônias mutantes observadas são esperadas, é melhor usar um marcador com um tamanho de alvo menor (por exemplo, ácido nalidixic). Veja a Figura 2B,onde as taxas de mutação do mutador constitutivo E. coli K-12 BW25113 ΔmutT foram estimadas usando ácido nalidixic como marcador. Ao trabalhar com cepas bacterianas não mutantes que têm um tipo selvagem (ou seja, normal) taxa de mutação, rifampicin é uma escolha melhor (ver Figura 2A). Se por algum motivo mais mutantes observados são necessários, um marcador relevante é a resistência a uma cicloserina. Para este marcador, mutações de resistência podem surgir em mais de dez genes41,o que significa que o tamanho do alvo é ainda maior do que para a rifampicina. Ao estudar levedura e arqueia, recomenda-se estimar as taxas de mutação em proteínas ribossômicas 25S e URA3, conferindo resistência à hitalmicina B e 5 fluoro-ácido orotic (5-FOA), respectivamente.
A segunda consideração crítica é o volume de culturas paralelas. Qual volume usar depende do número real de mutantes observados. O número esperado de mutantes observados é afetado pelo tamanho alvo do marcador pofonípico escolhido, da capacidade da cepa de reparar e evitar mutações (a taxa média de mutação) e a capacidade de carga do meio ambiente, que é afetada tanto pela mídia utilizada quanto pelo volume de cultura. Se nenhuma cultura paralela contem colônias mutantes resistentes à rifampicina, então a cicloserina deve ser usada ou o número de células banhadas deve ser aumentado. Isto pode ser conseguido adicionando mais glicose a um meio mínimo ou cultivando pilhas em um ambiente mais rico (ou completo). No entanto, em muitos casos, tal aumento na densidade populacional está associado a uma redução na taxa de mutação, resultando em aumento limitado, se houver, no número de colônias mutantes observadas10. Se aumentar os nutrientes não é uma solução, então aumentar o número de células, aumentando o volume de cada cultura paralela é uma opção. Quando o ambiente inclui sais mínimos com açúcar como única fonte de carbono e energia (ou seja, a resposta ao segundo trimestre na Figura 3 é “médio mínimo”), então volumes entre 0,5 e 1,5 mL devem ser usados. Se o ambiente é rico, então os volumes de culturas paralelas devem estar entre 0,35-1 mL. A última pergunta diz respeito ao número médio de colônias resistentes. Se muito poucas colônias mutantes forem observadas (ou seja, a resposta ao 3º trimestre na Figura 3 é 0) e o ambiente não deve ser modificado, então o volume de culturas paralelas deve ser aumentado ou o antibiótico com um tamanho alvo maior (por exemplo, cicloserina) deve ser usado. Por outro lado, se muitas colônias mutantes forem observadas em todas as placas seletivas (mais de ~150 por placa, ver a Figura 3),então o número de células banhadas deve ser diminuído, o que geralmente significa usar um volume menor ou mudar para um antibiótico com um tamanho alvo menor (por exemplo, ácido nalíptico).
Uma vez que o volume é escolhido, é melhor que todas as culturas paralelas em uma placa de poço profundo 96 têm o mesmo volume. Isso permite uma determinação mais precisa do volume real de culturas paralelas do peso da placa. Quando as taxas de mutação de um genótipo específico são comparadas entre diferentes ambientes, é novamente melhor usar o mesmo volume de culturas paralelas em todos os ambientes. Se o ácido nalidixic é usado estimando o tipo selvagem (isto é, normal) taxas de mutação ou algum outro marcador pednotypic é usado que tem um tamanho de alvo ainda menor do que o ácido nalidixic, o volume deve ser aumentado ainda mais. Uma opção é fazer culturas paralelas em tubos de 50 mL com volumes de até 15 mL. Por exemplo, 10 culturas paralelas mL foram preparadas em tubos de 50 mL ao estimar a taxa de mutação E. coli K-12 MG1655 para ácido nalidixic (ver Figura 2A). As culturas paralelas de 10 mL foram então banhadas no ágar ta seletivo e despejadas em grandes placas de 150 mm em vez de placas de Petri padrão de 90 mm. A desvantagem de preparar culturas paralelas em tubos de 50 mL é que a taxa de rendimento é consideravelmente menor em comparação com as taxas de mutação em uma placa de poço de 96 profundidade. Uma solução é diminuir o número de culturas paralelas. No entanto, isso afetará a precisão para a estimativa de m, que depende do número esperado de eventos mutacionais e do número de culturas paralelas26. A obtenção de uma distribuição de mutantes observados com culturas paralelas de 14 a 17 (como foi feito na Figura 2),é um bom equilíbrio entre uma taxa de transferência sólida e um nível de precisão aceitávelde 26 de 20%. Um nível médio de precisão de 17,5% é semelhante à precisão mediana com uma faixa interquartil de 16,4% (5,7%−38,9%, n = 580) calculada a partir de um conjunto de dados muito maior10. Assim, recomenda-se que, ao preparar culturas paralelas em 96 placas de poços profundos ou 50 tubos mL, a distribuição de mutantes observados seja obtida com pelo menos 14 culturas paralelas. Quando as taxas de mutação são estimadas em diferentes ambientes, recomenda-se testar os níveis de precisão fazendo um experimento multiplacal, onde todas as 96 culturas paralelas em uma placa são cultivadas no mesmo ambiente. Além disso, ao preparar culturas paralelas, é fundamental que a inocula contenha um baixo número de células, pois reduz as chances de quaisquer células resistentes estarem presentes no inóculo. Mutantes resistentes pré-existentes não são desejados no inóculo, porque eles vão aumentar em números e criar um gramado em placas seletivas e estimativa da taxa de mutação não será possível. Por exemplo, na maioria das populações não-mutantes de E. coli, a taxa de mutação para a resistência à rifampicina está na ordem de ~10-8 . Assim, para evitar inocular a cultura com um mutante resistente pré-existente, deve-se inocular com menos de 108 células (por exemplo, 103a 104 células). O passo crítico final é garantir que, antes que placas seletivas de ágar sejam incubadas, a superfície na ágar seletiva está completamente seca. Os espalhadores não podem ser usados se as placas de 6 poços forem usadas e o volume inicial de uma cultura paralela for de 1 mL, por exemplo. As placas devem ser deixadas descobertas em condições estéreis para deixar o líquido de superfície secar. O tempo que isso leva pode ser altamente variável, dependente de condições ambientais e da condição das placas. Desta vez deve ser minimizado, mas pode ser de até várias horas.
O ensaio de flutuação tem restrições inerentes. Ele diz marcadores phenotipicos de mutação apenas em um pequeno subconjunto do genoma. O ensaio exige assim as grandes populações que atravessam um número suficiente de gerações observar bastante mutações para estimar uma taxa de todo. Isto significa que os ensaios de flutuação só podem ser usados em organismos que são capazes de passar por um grande número de gerações rapidamente, como bactérias, levedura de padeiro42, ou células de mamíferos de cultura líquida30. Além disso, mutações são eventos raros que ocorrem nas circunstâncias bioquímicas específicas de uma determinada célula. O fato de que os ensaios de flutuação olhar através de grandes populações de células ao longo do tempo significa que essas circunstâncias podem diferir substancialmente. Usando este ensaio, é assim difícil estudar a progressão das taxas de mutação de uma população particular da fase da retardação à fase exponencial adiantada e atrasada e finalmente a uma fase estacionária. Qualquer diferenciação das taxas de mutação entre as células únicas dentro da população está completamente oculta do ensaio de flutuação. A dinâmica da mutação unicelular pode ser estudada com um rastreamento de molécula única da proteína de reparo de DNA MutS43 ou contando focos de proteínas MutL acumuladas44. Os recentes avanços no sequenciamento de alta taxa de taxas de alta taxa também tornaram possível estimar diretamente as taxas de mutação dos trios pais-descendentes9,45 e pedigrees multigeração46. Tais avanços metodológicos estão começando a permitir a contagem direta de mutações que ocorrem dentro de uma única geração. No entanto, essa abordagem direta precisa de tecnologias caras e de última geração, como microscopia de fluorescência, microfluídica ou sequenciamento de genoma inteiro. Por outro lado, o ensaio de flutuação é relativamente barato e apenas equipamentos laboratoriais padrão são necessários. Fazer mais ensaios de flutuação também facilitará a geração de novas hipóteses que podem ser testadas com abordagens unicelulares mais diretas.
Há um interesse de longa data no estudo de mutações, de modo que o ensaio de flutuação provavelmente continuará a ser um método amplamente utilizado. O número de citações do artigo seminal de Luria e Delbrück5 nos últimos 4 anos (2015-2018) estão entre os cinco primeiros para citações deste artigo. No entanto, devido a uma grande quantidade de trabalho manual preciso necessário para realizar adequadamente um ensaio de flutuação, a maioria dos estudos apenas realizar um punhado de ensaios de flutuação. Isto, entretanto, é insuficiente revelar as dependências ambientais da taxa da mutação. Ao simplificar os ensaios de flutuação usando placas multiwell, como explicado neste artigo, a taxa de pagamento máxima atual possível é de 11 placas de poços profundos (55 ensaios de flutuação) em paralelo, conforme descrito aqui. Executar dois conjuntos de ensaios de flutuação escalonados por um dia em paralelo, permite a realização de até 110 ensaios por semana. Outra mudança de etapa na entrada ainda pode ser possível automatizando várias etapas dos ensaios de flutuação do protocolo puramente manual dado. Além disso, para estudar as dependências ambientais da taxa de mutação, a densidade populacional precisa ser levada em conta. Resultados anteriores10 mostram que, quando fatores conhecidos que afetam a taxa de mutação são contabilizados, o controle da densidade populacional pode reduzir a variação nas estimativas da taxa de mutação em mais de 90%. Para controlar a densidade, recomendamos que o TN (usado para estimar a taxa de mutação) seja determinado independentemente do método usado para determinar a densidade populacional. Em bactérias, Nt pode ser determinado pela CFU e densidade, por exemplo, com um ensaio de luminescência à base de ATP10.
A alta produtividade e a densidade de controle são essenciais ao estudar como o contexto ecológico de um organismo afeta a taxa de mutação espontânea. Conhecer a existência da plasticidade da taxa de mutação é importante, mas compreender suas causas e efeitos são desafios-chave que precisam ser atendidos para que a plasticidade da taxa de mutação seja incorporada em um contexto biológico mais amplo. O ensaio de flutuação é uma grande ferramenta que pode ser usada para testar muitas hipóteses, porque os resultados são obtidos rapidamente, e os ensaios são baratos em relação a outros métodos. O cenário está configurado, por exemplo, para estudar as dependências ambientais da taxa de mutação em comunidades bacterianas e microbiomas. Adaptar o ensaio de flutuação às coculturas pode testar a hipótese de que as cepas influenciam as taxas de mutação uns dos outros através de pequenas moléculas. Fazer milhares de ensaios de flutuação com coculturas pode determinar se as cepas variam tanto em sua capacidade de modificar as taxas de mutação uns dos outros e em sua susceptibilidade de ter sua taxa de mutação modificada por outros. Talvez a variação entre as tensões na susceptibilidade à manipulação da taxa de mutação seja atribuível à variação genética específica. Isso pode transformar nossas opiniões sobre como a evolução funciona em comunidades complexas, não menos importante em exemplos de grande importância, como a forma como a resistência antimicrobiana emerge.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Rk foi apoiado pelo BB/M020975/1 e pela University of Manchester School of Biological Sciences. O RH foi apoiado pelo BB/J014478/1. A GG contou com o apoio da PARCERIA BBSRC de Formação de Doutoramento BB/M011208/1. A DRG foi apoiada pelo número de prémios MR/R024936/1 do UKRI.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Starlab International GmbH | S1615-5550 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | T8877-10g | |
| 6-well plates | Greiner Bio-One | REF 657102 | |
| 90mm Petri Dishes Triple Vented | ThermoFisher Scientific | REF 120189 | |
| 96 deep-well plate (Masterblock 2 ml) | Greiner Bio-One | REF 780270 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A/6440/53 | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | REF 214010 | |
| Bacto yeast extract | Becton, Dickinson and Company | REF 212750 | |
| Cycloserine | Sigma-Aldrich | 1158005-250MG | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
| D-Glucose anhydrous | Fisher Chemical | G/0500/61 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | REF 430828 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256-500g | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Chemical | M/1050/53 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878-5G | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
| Potassium phosphate dibasic trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504-500g | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500g | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp, USA | 557303-1GM | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| Spectophotometer | Jenway | 6320D | |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625-25g | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-500g | |
| Tryptone | Fisher Chemical | 1278-7099 |
Referanslar
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