Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Rok Kra&#353;ovec; Huw Richards; Guillaume Gomez; Danna  R. Gifford; Adrien Mazoyer; Christopher  G. Knight

doi:10.3791/60406

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Genetik

Mesurer les taux de mutation microbienne avec l'exemple de fluctuation

Published: November 28, 2019

doi:

10.3791/60406

Rok Krašovec¹, Huw Richards^2,3, Guillaume Gomez³, Danna R. Gifford¹, Adrien Mazoyer⁴, Christopher G. Knight³

¹School of Biological Sciences,The University of Manchester, ²School of Science,University of Waikato, ³School of Natural Sciences,The University of Manchester, ⁴Department of Mathematics,Université du Québec à Montréal

Özet

Ici, un protocole est présenté pour effectuer un assay de fluctuation et estimer le taux de mutation microbienne utilisant des marqueurs phénotypiques. Ce protocole permettra aux chercheurs d’examiner les mutations dans divers microbes et environnements, en déterminant comment le génotype et le contexte écologique affectent les taux de mutation spontanée.

Abstract

Les essais de fluctuation sont largement utilisés pour estimer les taux de mutation chez les microbes qui poussent dans les environnements liquides. Beaucoup de cultures sont chacune inoculées avec quelques milliers de cellules, chacune sensible à un marqueur sélectif qui peut être évalué phénotypiquement. Ces cultures parallèles se développent pendant de nombreuses générations en l’absence du marqueur phénotypique. Un sous-ensemble de cultures est utilisé pour estimer le nombre total de cellules à risque de mutations (c.-à-d. la taille de la population à la fin de la période de croissance, ou N_t). Les cultures restantes sont plaquées sur l’agar sélectif. La répartition des mutants résistants observés entre les cultures parallèles est ensuite utilisée pour estimer le nombre prévu d’événements mutationnels, m, à l’aide d’un modèle mathématique. La division m par N_t donne une estimation du taux de mutation par locus par génération. L’analyse comporte trois aspects critiques : le marqueur phénotypique choisi, le volume choisi de cultures parallèles et l’assurance que la surface de l’agar sélective est complètement sèche avant l’incubation. L’analyse est relativement peu coûteuse et ne nécessite que de l’équipement de laboratoire standard. Il est également moins laborieux que les approches alternatives, telles que l’accumulation de mutation et les essais unicellulaires. L’analyse fonctionne sur les organismes qui traversent de nombreuses générations rapidement et il dépend des hypothèses sur les effets de remise en forme des marqueurs et la mort cellulaire. Cependant, les outils et les études théoriques récemment mis au point signifient que ces questions peuvent maintenant être abordées de façon analytique. L’assay permet l’estimation du taux de mutation de différents marqueurs phénotypiques dans les cellules avec différents génotypes de plus en plus isolés ou dans une communauté. En effectuant plusieurs essais en parallèle, des essais peuvent être utilisés pour étudier comment le contexte environnemental d’un organisme affecte le taux de mutation spontanée, ce qui est crucial pour comprendre la résistance aux antimicrobiens, la carcinogenèse, le vieillissement et l’évolution.

Introduction

En 1901, le botaniste néerlandais Hugo de Vries a inventé le terme mutation¹. Vingt-six ans plus tard, lorsque Hermann Joseph Muller découvrit l’action mutagène des rayons X², les mutations étaient déjà perçues comme l’un des moteurs de l’évolution. Cependant, la nature des mutations n’était pas claire. Pour répondre à la question fondamentale de savoir si des mutations émergent spontanément (c.-à-d. une mutation spontanée) ou en réponse à la sélection (c.-à-d. une mutation induite), une méthode était nécessaire pour observer les événements mutationnels. Une telle méthode permettrait de mesurer le nombre prévu de mutations par division cellulaire ou ce qui était déjà connu comme un taux de mutation³^,⁴.

Figure 1 : Illustration schématique de la façon d’effectuer l’épreuve de fluctuation avec une souche microbienne dans une plaque de puits profond de 96. (A) Inoculer et acclimater les cellules dans des tubes de 50 ml contenant cinq environnements différents (essais « rouges », « bleus », « verts », « violets » et « oranges »). (B) Préparer des cultures parallèles avec un petit nombre de cellules sensibles dans une plaque de puits profond de 96. L’analyse « rouge » a 20 cultures parallèles, tandis que les essais « bleus », « verts », « violets » et « oranges » ont tous 19 cultures parallèles. Les positions des cultures parallèles sur la plaque de puits profond 96 sont aléatoires. La randomisation peut être effectuée avec le script LayoutGenerator.R supplémentaire ou par un autre outil. La mise en page en haut à droite est le résultat de randomisation. (C) Incuber la plaque de puits profond 96 et permettre aux cellules de se diviser et de muter spontanément. Six cultures de puits profonds A1, B1, C1, E1, F1 et G1 montrent comment le nombre de mutants fluctue : 4, 0, 2, 2, 1 et 4 globules rouges après la troisième division cellulaire, respectivement. Le nombre de mutants diffère non seulement en raison du nombre différent de mutations spontanées (0, 1 ou 2 comme le montre la première cellule rouge), mais aussi parce qu’il est important lors d’un cycle culturel qu’une mutation de résistance émerge spontanément (division cellulaire 1, 2 ou 3). (D) Après l’incubation de la plaque de puits profond 96, le nombre de mutants est déterminé par le placage de 81 cultures parallèles. Sur la mise en page ce sont des cercles sans bords gras. Toute la culture parallèle est plaquée sur un puits d’une plaque de 6 puits contenant une agar sélective. (E) Les 15 cultures restantes sont diluées et plaquées sur l’agar non sélectif pour déterminer le nombre moyen de cellules (N_t). Sur la disposition, ceux-ci sont étiquetés comme Ntwells et ont des bords en gras. Pour chaque antodonte, N_t est en moyenne sur trois cultures parallèles. En bas à droite se trouve un plat Petri contenant une plaque d’agar non sélective avec 25 UFC d’une culture diluée cultivée dans un puits profond D1 (une partie d’un «vert» d’assay). (F) Après l’incubation des 6 plaques sélectives de puits, le nombre de mutants observés a été compté et le nombre prévu d’événements mutationnels, m, a été estimé à l’aide d’un estimateur de probabilité maximale. (G) Connaissant à la fois le nombre de mutations, m, et le nombre de cellules par résultat, N_t, le taux de mutation a été estimé comme m/N_t. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Salvador Luria et Max Delbruck en 1943 ont fourni une solution ingénieuse à ce problème avec l’assay de fluctuation⁵ (voir Figure 1). L’astodonte commence par de multiples populations (appelées cultures parallèles) qui sont initiées par un petit nombre de cellules microbiennes(figure 1A,B). Après la croissance dans un environnement bénin et non sélectif (figure 1C),les cultures parallèles sont transférées sur des plaques contenant un marqueur sélectif (phages, antibiotiques, etc.), où seules les cellules ayant une mutation de résistance survivent et peuvent produire une colonie (Figure 1D). L’attente principale était que si des mutations de résistance sont induites, le nombre de cellules qui portent une mutation devrait être distribué parmi différentes populations avec la moyenne égale à la variance. Ce que Luria et Delbruck ont constaté avec l’exemple de fluctuation, c’est que le nombre de mutants a fluctué considérablement et que la variance du nombre de mutants entre les différentes populations était considérablement plus grande que la moyenne. Luria et Delbruck ont ainsi démontré que les mutations sont spontanées. Ils ont montré que des mutations émergent spontanément chaque fois que l’ADN est reproduit, et le nombre de mutants dépend du moment où la mutation se produit pendant la croissance de la population. Voir Figure 1C, où six populations, chacune initiée avec une cellule microbienne (en bleu), n’éprouvent aucune, 1 ou 2 mutations uniques. Les populations A1, E1 et F1 ont connu une seule mutation (première cellule rouge), mais parce qu’une seule mutation émerge spontanément à divers moments au cours d’un cycle culturel, les populations se sont retrouvées avec un nombre très différent de mutants observés (quatre, deux et un, respectivement). D’autre part, les populations C1 et G1 se sont retrouvées avec le même nombre de mutants observés que E1 et A1, en dépit de l’expérience de deux événements mutationnels plutôt qu’un. La fluctuation des mutants observés parmi les populations a non seulement donné le nom de l’analyse, mais a également montré qu’une fréquence mutante (c.-à-d., la proportion de cellules mutantes) est un indicateur inadéquat du taux de mutation.

L’objectif global de l’analyse de fluctuation est d’estimer le taux de mutation spontané d’un génotype particulier de bactéries ou d’un autre organisme unicellulaire qui pousse dans un environnement liquide particulier. L’analyse de fluctuation demeure l’outil le plus approprié pour étudier la dépendance environnementale des taux de mutation microbienne et permet une estimation rapide et peu coûteuse du taux de mutation. Les approches alternatives à l’estimation du taux de mutation, telles que le séquençage à profondeur maximale⁶, le séquençage de la population⁷, les expériences d’accumulation de mutation⁸, ou la comparaison des séquences génomiques d’une progéniture à celles des parents⁹ sont beaucoup plus laborieuses, et donc mal adaptées à la détection potentielle de dépendances environnementales. Cependant, les aspects dynamiques de la génération et de la réparation d’une mutation sont en grande partie inaccessibles à un essai de fluctuation ou à l’une des méthodes d’analyse d’un taux de mutation énumérés ci-dessus. Pour étudier comment le nombre de mutations change dans le temps, l’espace ou parmi les cellules individuelles au sein d’une population, les approches à cellule^{unique 11}^,¹² sont nécessaires, ce qui, en plus d’être plus laborieux que les essais de fluctuation, nécessitent des compétences hautement spécialisées et de l’équipement.

Dans la pratique, un point de repère de fluctuation consiste à compter les cellules qui gagnent un marqueur phénotypique en raison d’une mutation qui se produit dans un environnement qui manque de sélection pour ce marqueur. La méta-analyse de centaines d’essais publiés¹⁰ montre qu’au moins 39 marqueurs phénotypiques différents ont été utilisés depuis la création de l’analyse en 1943. L’essai de fluctuation peut être utilisé pour comparer les moyennes et la dépendance environnementale des taux de mutation entre les souches de laboratoire, cliniques, non mutateurs et mutateurs qui poussent dans des environnements permissifs. L’analyse permet l’estimation du taux de mutation dans les cellules ayant des antécédents génétiques différents de plus en plus dans des environnements minimaux ou riches. L’analyse convient non seulement aux populations qui grandissent sous forme de monoculture, mais peut également être utilisée pour étudier les effets des interactions cellules-cellules sur les taux de mutation¹¹. Lorsque la souche d’intérêt est co-cultivée avec une deuxième souche, et un marqueur neutre est utilisé pour distinguer les souches, les taux de mutation peuvent être évalués pour deux souches dans le même tube en même temps.

Les essais de fluctuation ont révélé que le taux de mutation spontanée dépend à la fois du génotype d’une cellule et de son environnement¹² et est un trait qui lui-même évolue¹³. Chaque fois que le taux de mutation d’un génotype particulier change avec l’environnement, il est décrit comme la plasticité de taux de mutation¹¹. Les taux de mutation plastique ont été les plus soigneusement abordés pour la mutagénèse induite par le stress (SIM)¹⁴. En outre, en utilisant des tests de fluctuation, il a été récemment démontré que la densité à laquelle une population de cellules se développe (généralement une culture de lots à la capacité de charge) est étroitement associée aux taux de mutation à travers les bactéries et les eucaryotes unicellulaires. Le taux de mutation par génome par génération diminue dans les populations denses jusqu’à 23 fois¹⁰^,¹¹. Cette plasticité de taux de mutation associée à la densité (DAMP) peut dépendre d’un système de détection de quorum¹⁵ et agir indépendamment de SIM¹⁶.

Ici, un protocole détaillé est présenté pour l’analyse de fluctuation utilisée pour étudier la souche Escherichia coli K-12 gagnant la résistance à la rifampicinantique antibiotique dans un environnement média minimal de glucose. Cependant, ce protocole devrait être considéré comme un modèle de base qui peut être utilisé pour étudier une grande variété de microbes en modifiant simplement les conditions de culture et les marqueurs phénotypiques de la mutation. Le protocole a évolué depuis sa création⁵^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹ grâce à son utilisation sur un large éventail de microbes et même les cellules cancéreuses³⁰ et a été modifié pour augmenter le débit, qui était essentiel pour tester correctement les dépendances environnementales des taux de mutation microbienne¹⁰^,¹¹^,¹⁶. Le protocole décrit ici ne couvre pas toutes les questions méthodologiques et analytiques de l’essai de fluctuation qui ont déjà été bien discutés dans la littérature, en particulier les effets de forme physique des mutations résistantes³¹, retard phénotypique³², la mort cellulaire³³, et la pertinence de divers algorithmes disponibles pour estimer les taux de mutation²⁶^,³⁴. Cela peut être important, par exemple, lorsque la dépendance environnementale des effets de remise en forme peut donner lieu à une variation erronée dans les estimations du taux de mutation³⁵. Cependant, nous notons que les outils analytiques que nous utilisons ici peuvent faire face à la variation de la condition physique mutante et la mort cellulaire. Tel qu’il est abordé dans les notes et la discussion, il est également recommandé de tenir compte de multiples marqueurs phénotypiques qui sont peu susceptibles d’avoir les mêmes effets de condition physique dépendants de l’environnement. Ce protocole permettra aux gens d’examiner régulièrement les dépendances environnementales des taux de mutation dans la diversité des souches et des environnements microbiens. Les mutations d’essai dans différents environnements n’ont pas encore été soigneusement testées et une fois que la densité de population est considérée, les essais de fluctuation peuvent donner une estimation plus précise du taux de mutation¹⁰. Ce protocole permettra d’effectuer davantage d’analyses de fluctuation, comme c’est nécessaire pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent les taux de mutation, ce qui est essentiel pour comprendre l’évolution, la carcinogenèse, le vieillissement et la résistance aux antimicrobiens.

Protocol

1. Jour 1 : Inoculation et acclimatation des cultures Inoculer 3 ml de bouillon de lysogénie liquide (LB, voir Tableau supplémentaire 1) avec une éraflure de glace du stock de glycérol E. coli MG1655 (18 % de glycérol, -80 oC). Secouez la culture LB à 120 tr/min pour 7 h à 37 oC.REMARQUE: Dans cette expérience, E. coli K12 MG1655 de plus en plus en LB est utilisé, mais cet analyse peut être effectué avec n’importe quelle souche E. coli ou toute autre espèce microbienne culturable. La température d’incubation, les temps d’incubation et le niveau d’éléments nutritifs des supports de croissance peuvent tous être sujets à des variations selon les espèces ou les souches. Diluer la culture 2 000 fois à l’aide de la solution saline. Ajouter 100 l de la solution diluée à trois tubes coniques de polymère à fond conique de bouchon de vis de 50 ml (tubes de 50 ml) avec 10 ml de milieu minimal Liquide Davis (DM, voir le tableau supplémentaire 1), contenant respectivement 80 mg/L, 125 mg/L, ou 250 mg/L de glucose. Il s’agit du même milieu (c.-à-d. environnement) dans lequel le taux de mutation sera estimé. Secouez les cultures à 120 tr/min pendant la nuit à 37 oC.REMARQUE: Le choix des médias est sujet à des variations selon les espèces, les souches ou les questions de recherche. 2. Jour 2: Génération de mutants dans les cultures parallèles Tout d’abord, préparer les environnements dans lesquels les bactéries seront cultivées. Toujours préparer 10% de plus que nécessaire (c’est-à-d. vingt 1 ml cultures nécessitent 22 ml). Préparer 22 mL de 1) DM avec 80 mg/L de glucose, 2) DM avec 125 mg/L de glucose, 3) DM avec 250 mg/L de glucose, 4) DM avec 80 mg/L de glucose, et 5) DM avec 250 mg/L de glucose dans cinq tubes de 50 ml. Étiquetez-les comme GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B et GLC-250B, respectivement. Préparer l’inocula pour les environnements. Assurez-vous que l’inoculum de 1 ml de l’environnement contient de 1 000 à 5 000 cellules. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous. Mesurer la densité optique (OD) des cultures du jour au lendemain (à partir de l’étape 1,2) à 600 nm. Diluer chaque culture du jour au lendemain afin d’atteindre une densité finale de 1 000 à 5 000 cellules par mL de DM avec du glucose. Dans nos mains, si l’OD mesurée en 2,2,1 est de 0,3, cela signifie faire une dilution 100 fois (en solution saline) de la culture du jour au lendemain, puis ajouter 11 ‘l de cette solution à l’environnement de 22 mL. Préparer des cultures parallèles.REMARQUE : Ce protocole est écrit pour une plaque de puits profond de 96, effectuant cinq essais de fluctuation (le nombre raisonnable maximum sur une plaque de puits 96), utilisant trois environnements. Avec l’expérience, plusieurs plaques de puits profonds peuvent être exécutés en parallèle. Créez une disposition aléatoire des cultures parallèles pour une plaque de puits profond de 96. Le script R supplémentaire LayoutGenerator.R (voir la mise en page dans la figure 1B) peut être utilisé pour cela. Placez chaque culture parallèle sur la plaque de puits profond 96 en fonction de la disposition.REMARQUE: Exécution de la LayoutGenerator.R veillera à ce que le premier analyse a 20 cultures parallèles, et que les deuxième, troisième, quatrième et cinquième essais ont 19 cultures parallèles chacun. Transférer 1 mL de support inoculé dans chaque puits d’une plaque de puits profond de 96 selon la disposition randomisée. Fixer le couvercle de la plaque de puits profond avec le ruban adhésif. Ne fixez pas le couvercle hermétiquement, parce que la croissance de la culture est sensible à la quantité d’aération. Peser toute la plaque avec le couvercle et le ruban adhésif et secouer la plaque à 250 tr/min pendant 24 h à 37 oC. Placer 2 L d’eau distillée dans l’incubateur pour stabiliser la quantité d’évaporation entre les ensembles expérimentaux. Déterminer la taille de l’inoculum en placageant 10 ll de chacun des supports inoculés sur la plaque d’agar non sélective Tetrazolium (TA) (voir tableau supplémentaire 1). Utilisez un épandeur stérile en forme de L jusqu’à ce que la surface de l’agar soit sèche. Incubate TA agar plaques couvercle vers le bas pendant la nuit à 37 oC.REMARQUE: TA agar est une gélose riche qui contient le sucre L-arabinose et le colorant soluble dans l’eau 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorure, qui est incolore dans sa forme oxydée. Lorsque les bactéries réduisent le colorant, il devient rouge en raison de la formation de formazan. Les colonies sur l’agar TA qui ne peuvent pas utiliser L-arabinose sont rouge foncé. D’autres souches, comme MG1655, sont rosées. L’utilisation de l’agar de TA plutôt que l’agar standard de LB est recommandée parce que les colonies bactériennes colorées sont plus faciles à repérer, qui rend le comptage de colonie plus fiable et plus rapide. Préparer l’agar TA sélectif contenant de la rifampicine dans 6 plaques de puits. Pipette 5 ml de l’agar TA sélectif dans chaque puits des 6 plaques de puits. Préparer la rifampicinantique antibiotique juste avant qu’il ne soit ajouté à l’agar TA.REMARQUE : Quand la cycloserine est employée comme marqueur, utilisez le milieu minimal de Davis avec 250 mg/L de glucose complété avec l’agar et le L-arabinose et le chlorure de 2,3,5-triphenyltetrazolium comme agar sélectif. À savoir, L’agar TA ne sélectionne pas seulement les cellules qui sont résistantes à la cycloserine, parce que l’extrait de tryptone et de levure (les deux composants essentiels de l’agar De A) contiennent l’acide aminé D-alanine. Cet acide aminé contrarie l’effet antimicrobien de la cycloserine et permet à toutes les cellules de faire une colonie. Laisser les plaques sélectives et non sélectives restantes dans l’obscurité (p. ex., dans une boîte) à température ambiante. 3. Jour 3 : Placage des cultures sur les plaques d’agar sélectives et non sélectives Compter les unités de formation de colonies (UFCC) sur les plaques d’agar non sélectives et déterminer la taille de l’inocula en multipliant l’UFC par 100. Il s’agit d’un rapport entre un volume de la culture parallèle (1 mL et 1 000 l) et le volume plaqué (10 l).REMARQUE: Si les plaques non sélectives sont stockées au réfrigérateur, le CFU peut être compté plus tard. Après 24 h d’incubation, peser toute la plaque de puits profond pour déterminer la quantité d’évaporation. Il s’agira probablement d’environ 10 %. Calculer le volume moyen d’une culture parallèle après 24 h d’incubation (V[24h]) en microlitres à l’aide d’un volume de départ V[0h] et le poids de la plaque converti en microlitres, où la densité du milieu de croissance est mesurée en mg/l. Cette étude utilise une densité de 1 mg/l : Transférer les trois cultures choisies au hasard par essai (15 au total, soulignées d’un cercle noir dans la disposition de la figure 1B) dans des tubes de microcentrifuge étiquetés. Laissez-les sur le banc pour être utilisés plus tard (voir l’étape 3.6) pour déterminer la taille finale de la population (ou Nt). Plaquer les 81 cultures parallèles restantes de la plaque de puits profond sur l’agar sélectif de TA contenant la rifampicine. Pipette une culture parallèle entière de la plaque de puits profond 96 dans un puits d’une plaque de 6 puits. Assurez-vous que n’importe quelle plaque de puits 6 contient des cultures parallèles de plus d’un jeu de fluctuation. Retirer les couvercles des plaques d’agar sélectives et laisser à découvert dans des conditions stériles. Séchez tout le liquide à la surface de l’agar TA sélectif.REMARQUE: L’agar étant complètement sec est critique. Cependant, ne pas trop sécher l’agar TA sélectif, car il ne doit pas être autorisé à se fissurer. Pendant que les plaques sélectives d’agar TA sèchent, ce qui peut prendre jusqu’à plusieurs heures, déterminez Nt des 15 cultures préparées à l’étape 3.4 à l’aide d’unités de formation de colonies (CFU). Déterminer l’UFC en diluant les cultures des tubes de microcentrifuge. Utilisez cinq étapes de dilution 10 fois plus tadines, en mélangeant et en vortexant 900 l de solution saline avec 100 l de la culture à chaque étape. Plaque 40 ‘L de la dernière dilution (avec un facteur de dilution de 105) sur l’agar Non sélectif TA et les plaques d’incubation couvercle vers le bas pendant la nuit à 37 oC.REMARQUE: La série de dilution en 96 plaques de puits peut être réalisée avec une pipette multicanal, ce qui peut augmenter la vitesse de cette étape. Une fois que tous les puits sur une plaque de 6 puits sont exempts du liquide de culture, remettez le couvercle et placez la plaque de 6 puits avec le couvercle vers le bas sur le banc jusqu’à ce que toutes les 6 plaques de puits soient sèches. Une fois que tous sont secs, incuber le couvercle des plaques vers le bas à 37 oC pendant 44-48 h.REMARQUE: Pour d’autres marqueurs (acide nalidixique, cycloserine, hygromycine B, ou 5-FOA) incuber les plaques pendant 68-72 heures. Assurez-vous que l’humidité dans l’incubateur est élevée. Il est essentiel que les plaques d’agar sélectives ne se dessèchent pas pendant la période d’incubation. 4. Jour 4 : Détermination du nombre de cellules dans les cultures Comptez le CFU sur les plaques d’agar non sélectives. Estimer le nombre de cellules viables dans la culture en multipliant le CFU avec le facteur de dilution (105) et le rapport entre le volume moyen calculé V[24h] en microlitres (voir l’étape 3.3) et le volume plaqué (40 l) : Nt d’un génotype particulier qui pousse dans un environnement particulier est la moyenne de ces valeurs des trois cultures. 5. Jour 5 : Estimation du taux de mutation Comptez le nombre de colonies résistantes à l’antibiotique sur les plaques sélectives d’agar TA (c.-à-d., le nombre de cellules résistantes qui sont apparues par mutation spontanée dans la plaque de puits profond les jours 2-3). Enregistrez la répartition entre les cultures parallèles du nombre observé de mutants pour un analyse particulier (p. ex., 16 ou 17 valeurs, y compris zéro dénombrement).REMARQUE : Si les plaques sélectives sont stockées au réfrigérateur, les colonies résistantes à l’antibiotique peuvent être comptées plus tard. Utilisez chaque distribution pour estimer le nombre d’événements mutationnels, m, en utilisant le Flan R-package36.REMARQUE: Il ya aussi le R-package rSalvador avec des fonctionnalités similaires29. Enregistrer la distribution des mutants observés pour un analyse dans un fichier texte comme une seule colonne. Utilisez le logiciel Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) pour estimer m comme détaillé ci-dessous. Dans l’onglet L’hypothèse Test des valeurs de congé en tant que défauts (c.-à-d., fitness inconnu coché, Méthode d’estimation – Probabilité maximale (ML), Distribution de la durée de vie des mutants – Exponential (modèle LD), Paramètre Winsor 1 024, Numéro de mutation et Fitness 1, Niveau de confiance – 0,95, Nombre de classe et Valeur maximale 100). Cliquez sur Parcourir et sélectionnez le fichier texte avec la distribution des mutants observés. Essayez d’abord avec le fichier de données supplémentaires. Après avoir téléchargé le fichier, cliquez sur Effectuer Test. Sur le côté droit sous le résultat du test, sous le modèle Un échantillon ML (LD), trouver le numéro de mutation. C’est m, le nombre prévu d’événements mutationnels. Sous l’intervalle de confiance de 95 pour cent pour le nombre de mutation trouver la limite supérieure et inférieure de m. Une fois que m et Nt (déterminés par CFU) sont disponibles, estimez le taux de mutation d’un génotype particulier dans un environnement particulier comme . Divisez les limites supérieure et inférieure sur m par Nt de la même manière pour générer des intervalles de confiance sur le taux de mutation (NB cela ne tient pas compte de l’incertitude dans Nt).REMARQUE: Les résultats sont présentés comme le taux de mutation par locus rpoB par génération. Le taux de mutation par paire de base est généré en divisant le taux de mutation par locus de rpoB par 79, qui est notre connaissance courante de combien de mutations de point dans un gène de rpoB confèrent la résistance à la rifampicin37. La multiplication du taux de mutation par nucléotide par la taille du chromosome(E. coli K-12 MG1655 – 4 639 675 pb), donne le taux de mutation par génome. Répétez les étapes 5.1-5.3 avec les quatre autres essais de fluctuation.

Representative Results

Les résultats ont été recueillis avec le protocole rapporté en quatre semaines différentes par trois chercheurs individuels différents, où chaque semaine une plaque de puits profond de 96 a été utilisée pour générer cinq estimations de taux de mutation. Au total, trois plaques de puits profonds de 96 ont généré 15 estimations du taux de mutation (intervalle de confiance de 95 % CI) dans E. coli K-12 MG1655(figure 2A, utilisée dans le protocole), tandis qu’une plaque de puits profond de 96 a été utilisée pour cinq estimations (95 % CI) de E. coli K-12 BW25113mutT mutant(figure 2B). Dans la figure 2, la précision médiane avec la plage interquartile de l’estimation m est de 17,5 % (1,00 % à 28,9 %, n – 20). La précision est un coefficient de la variation du nombre prévu d’événements mutationnels (m) calculé comme ‘m / m x 100% (où est calculé comme indiqué précédemment38). Les données brutes de la figure 2 sont disponibles dans le fichier de données supplémentaires “Krasovec_etal_JoVE_data.csv”. Le fichier de données supplémentaires est accompagné d’un script R pour générer la figure 2. Voir aussi le tableau 2 supplémentaire pour plus de détails sur les souches bactériennes, et le tableau supplémentaire 3, où les colonnes du fichier de données sont expliquées. Les points de données acquis avec de la rifampicine et de l’acide nalidixique ont déjà été publiés dans Kraovec etal.10 et ont les mêmes iD ici que lors de la première publication. Dans la figure 2A les taux de mutation MG1655 de trois marqueurs phénotypiques différents, cycloserine, rifampicin, et acide nalidixic sont présentés. Ici, des taux de mutation ont été évalués dans le milieu minimal de Davis avec 80, 125, et 250 mg/L de glucose, comme expliqué dans le protocole. Dans un cas, 1 000 mg/L de glucose ont été utilisés (figure 1B). Dans la pratique, toute concentration initiale de glucose peut être utilisée. Comme prévu, les taux de mutation étaient plus élevés pour la résistance à la cycloserine, les plus faibles pour la résistance à l’acide nalidixique, et le taux de résistance à la rifampicine était au milieu. Ceci est conforme aux tailles cibles connues pour ces trois résistances, où la plus grande est pour la cycloserine et la plus petite pour l’acide nalidixique. La discussion et la figure 3 donnent des détails sur la façon d’exploiter les tailles cibles, les volumes de cultures parallèles et le niveau de nutriments dans l’environnement afin d’optimiser la mesure des taux de mutation microbienne avec l’analyse de fluctuation. L’épreuve de fluctuation montre clairement quelle souche est un mutateur constitutif et qui a des taux de mutation normaux. La souchemutT avait un taux de mutation environ 50 fois plus élevé pour la résistance à l’acide nalidixique (figure 2B) comme MG1655 (Figure 2A). Cependant, pour déterminer le taux de mutation d’un génotype particulier dans différents environnements, il est recommandé de faire au moins cinq répliques par génotype par environnement à l’aide d’un seul marqueur phénotypique. Pour un aperçu détaillé des méthodes statistiques précédemment utilisées pour analyser ce type d’expérience, voir les informations supplémentaires dans Kraovec et al.10. Figure 2 : Chiffre représentatif des taux de mutation estimés par l’effort de fluctuation dans les populations d’Escherichia coli. (A) Le taux de mutation tel que déterminé par le protocole rapporté dans le type sauvage MG1655 (cercles). La figure montre les taux de mutation en présence de la rifampicine (cercles bleu clair), de l’acide nalidixique (cercles rouges) et de la résistance à la cycloserine (cercles bleus foncés). Pour l’acide nalidixique, des volumes de culture plus importants de 10 ml ont été utilisés (voir Dossier de données supplémentaires). Les données relatives à la rifampicine et à l’acide nalidixique sont retracées à partir de la figure 2a dans Kraovec et al.10. (B) Le taux de mutation de la résistance à l’acide nalidixique chez le mutant Keio39 mutT (triangles rouges). Notez l’échelle logarithmique sur l’axe de taux de mutation. Barres d’erreur : intervalles de confiance de 95 % calculés comme expliqué dans le protocole. Les données sont retracées à partir de la figure 4a dans Kraovec et al.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Graphique de dépannage de l’incardement de l’incardement. Le diagramme de flux doit être suivi par le haut, en abordant les trois questions dans les diamants jaunes à tour de rôle, en ajustant le protocole en fonction du contenu des boîtes vertes résultantes, et en mettant en œuvre le protocole comme indiqué dans les ovales rouges. Voir les trois premiers paragraphes de la discussion pour plus de détails sur la façon de dépanner. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Tableau supplémentaire 1 : Formules pour les médias utilisées dans le protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger). Tableau supplémentaire 2 : Souches bactériennes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger). Tableau supplémentaire 3 : Description détaillée des colonnes du fichier de données brutes Krasovec_etal_JoVE_data.csv. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger). Fichiers de données supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces fichiers.

Discussion

Toute estimation d’un taux de mutation doit maximiser la précision obtenue afin d’assurer la répétabilité et la reproductibilité à l’intérieur et entre les études³⁴. Pour un analyse de fluctuation, il y a trois considérations critiques. Les deux premiers ont été fixés dans le protocole donné, mais auront besoin de dépannage (voir la figure 3) si le protocole est adapté pour fonctionner avec différentes souches ou environnements. La première est de choisir le marqueur phénotypique approprié. Pour les bactéries, il est recommandé d’estimer les taux à l’un des deux repères loci, rpoB ou gyrA, conférant une résistance aux antibiotiques rifampicin et l’acide nalidixique, respectivement. La taille cible des mutations à la résistance aux antibiotiques à ces deux loci est différente. Il y a 79 et 20 mutations uniques conférant la résistance à la rifampicin37 et à l’acide nalidixic⁴⁰ respectivement. Dans la pratique, cela signifie qu’en moyenne, des mutants résistants à la rifampicine sont plus fréquemment observés. Donc, la première question (Q1 à la figure 3) qui doit être répondue est de savoir si oui ou non la souche est un mutateur. Lorsque les mutateurs constitutifs sont étudiés, où de nombreuses colonies mutantes observées sont attendues, il est préférable d’utiliser un marqueur avec une taille cible plus petite (par exemple, l’acide nalidixique). Voir figure 2B, où les taux de mutation du mutateur constitutif E. coli K-12 BW25113mutT ont été estimés à l’aide d’acide nalidixique comme marqueur. Lorsque vous travaillez avec des souches bactériennes non mutatrices qui ont un taux de mutation de type sauvage (c.-à-d. normal), la rifampicine est un meilleur choix (voir la figure 2A). Si, pour une raison quelconque, il faut plus de mutants observés, un marqueur pertinent est la résistance à une cycloserine. Pour ce marqueur, des mutations de résistance peuvent émerger dans plus de dix gènes⁴¹, ce qui signifie que la taille de la cible est encore plus grande que pour la rifampicine. Lors de l’étude de la levure et de l’archée, il est recommandé d’estimer les taux de mutation dans les protéines ribosomal 25S et URA3, conférant une résistance à l’hygromycine B et à l’acide 5-fluoro-orotique (5-FOA), respectivement.

La deuxième considération critique est le volume de cultures parallèles. Le volume à utiliser dépend du nombre réel de mutants observés. Le nombre prévu de mutants observés est affecté par la taille cible du marqueur phénotypique choisi, la capacité de la souche à réparer et à éviter les mutations (le taux de mutation moyen) et la capacité de charge de l’environnement, qui est affectée à la fois par les médias utilisés et le volume de culture. Si aucune culture parallèle ne contient de colonies mutantes résistantes à la rifampicine, alors la cycloserine doit être utilisée ou le nombre de cellules plaquées doit être augmenté. Ceci peut être réalisé en ajoutant plus de glucose à un milieu minimal ou en cultivant des cellules dans un environnement plus riche (ou complet). Cependant, dans de nombreux cas, une telle augmentation de la densité de population est associée à une réduction du taux de mutation, ce qui entraîne une augmentation limitée, voire aucune, du nombre de colonies mutantes observées¹⁰. Si l’augmentation des nutriments n’est pas une solution, puis augmenter le nombre de cellules en augmentant le volume de chaque culture parallèle est une option. Lorsque l’environnement comprend un minimum de sels avec le sucre comme seule source de carbone et d’énergie (c.-à-d. que la réponse au Q2 à la figure 3 est « milieu minimal »), alors des volumes compris entre 0,5 et 1,5 ml devraient être utilisés. Si l’environnement est riche, alors les volumes de cultures parallèles devraient être entre 0,35 et 1 ml. La dernière question concerne le nombre médian de colonies résistantes. Si trop peu de colonies mutantes sont observées (c.-à-d. que la réponse au Q3 à la figure 3 est 0) et que l’environnement ne doit pas être modifié, alors le volume de cultures parallèles devrait être augmenté ou l’antibiotique ayant une plus grande taille cible (p. ex., la cycloserine) devrait être utilisé. D’autre part, si beaucoup de colonies mutantes sont observées sur toutes les plaques sélectives (plus de 150 euros par assiette, voir Figure 3), alors le nombre de cellules plaquées devrait être diminué, ce qui signifie généralement l’utilisation d’un volume plus faible ou le passage à un antibiotique avec une taille cible plus petite (par exemple, l’acide nalidixique).

Une fois que le volume est choisi, il est préférable que toutes les cultures parallèles sur une plaque de puits profond 96 ont le même volume. Cela permet une détermination plus précise du volume réel des cultures parallèles à partir du poids de la plaque. Lorsque les taux de mutation d’un génotype particulier sont comparés entre différents environnements, il est à nouveau préférable d’utiliser le même volume de cultures parallèles dans tous les environnements. Si l’acide nalidixique est utilisé pour estimer les taux de mutation de type sauvage (c.-à-d. normaux) ou un autre marqueur phénotypique est utilisé qui a une taille cible encore plus petite que l’acide nalidixique, le volume doit être augmenté encore plus. Une option est de faire des cultures parallèles dans des tubes de 50 ml avec des volumes allant jusqu’à 15 ml. Par exemple, des cultures parallèles de 10 ml ont été préparées dans des tubes de 50 ml lors de l’estimation du taux de mutation E. coli K-12 MG1655 à l’acide nalidixique (voir la figure 2A). Les cultures parallèles de 10 ml ont ensuite été plaquées sur la gélose sélective TA et versées dans de grandes assiettes de 150 mm au lieu de plats Petri standard de 90 mm. L’inconvénient de la préparation des cultures parallèles dans des tubes de 50 ml est que le débit est considérablement plus faible par rapport aux taux de mutation d’analyse dans une plaque de puits profond de 96. Une solution consiste à réduire le nombre de cultures parallèles. Cependant, cela affectera la précision de l’estimation de m, qui dépend du nombre prévu d’événements mutationnels et le nombre de cultures parallèles²⁶. L’obtention d’une distribution de mutants observés avec 14 à 17 cultures parallèles (comme cela a été fait à la figure 2), est un bon équilibre entre un débit solide et un niveau de précision acceptable²⁶ de 20 %. Un niveau de précision médian de 17,5 % est similaire à la précision médiane avec une plage interquartile de 16,4 % (5,7 % à 38,9 %, n – 580) calculée à partir d’un ensemble de données beaucoup plus important¹⁰. Ainsi, il est recommandé que lors de la préparation des cultures parallèles dans 96 plaques de puits profonds ou 50 ml tubes de la distribution des mutants observés est obtenue avec au moins 14 cultures parallèles. Lorsque les taux de mutation sont estimés dans différents environnements, il est recommandé de tester les niveaux de précision en faisant une expérience multiplaque, où les 96 cultures parallèles sur une seule plaque sont cultivées dans le même environnement. En outre, lors de la préparation des cultures parallèles, il est essentiel que les inocules contiennent un faible nombre de cellules, car il réduit les chances de toutes les cellules résistantes étant présents dans l’inoculum. Les mutants résistants préexistants ne sont pas voulus dans l’inoculum, parce qu’ils augmenteront en nombre et créeront une pelouse sur des plaques sélectives et l’estimation du taux de mutation ne sera pas possible. Par exemple, dans la plupart des populations de E. coli non mutator, le taux de mutation à la résistance à la rifampicine est de l’ordre de 10^{à 8}. Ainsi, pour éviter d’inoculer la culture avec un mutant résistant préexistant, il faut inoculer avec moins de 10⁸ cellules (par exemple, 10³-10⁴ cellules). La dernière étape critique consiste à s’assurer qu’avant que les plaques d’agar sélectives ne soient incubées, la surface de l’agar sélectif est complètement sèche. Les épandeurs ne peuvent pas être utilisés si des plaques de 6 puits sont utilisées et que le volume initial d’une culture parallèle est de 1 ml, par exemple. Les plaques doivent être laissées à découvert dans des conditions stériles pour laisser sécher le liquide de surface. Le temps que cela prend peut être très variable, dépendant des conditions ambiantes et de l’état des plaques. Ce temps doit être réduit au minimum, mais peut être jusqu’à plusieurs heures.

L’exemple de fluctuation comporte des contraintes inhérentes. Il n’analyse les marqueurs phénotypiques de la mutation que dans un petit sous-ensemble du génome. L’astodonte nécessite donc de grandes populations qui traversent un nombre suffisant de générations pour observer suffisamment de mutations pour estimer un taux du tout. Cela signifie que les essais de fluctuation ne peuvent être utilisés que sur les organismes qui sont capables de traverser un grand nombre de générations rapidement, comme les bactéries, la levure de boulanger⁴², ou les cellules de mammifères de culture liquide³⁰. En outre, les mutations sont des événements rares se produisant dans les circonstances biochimiques spécifiques d’une cellule particulière. Le fait que les essais de fluctuation examinent de grandes populations de cellules au fil du temps signifie que ces circonstances peuvent différer considérablement. En utilisant cet essai, il est donc difficile d’étudier la progression des taux de mutation d’une population particulière de la phase de décalage à la phase exponentielle précoce et tardive et enfin à une phase stationnaire. Toute différenciation des taux de mutation entre les cellules individuelles au sein de la population est complètement cachée de l’état d’as. La dynamique des mutations unicellulaires peut être étudiée avec un suivi à molécule unique de la protéine de réparation de l’ADN MutS⁴³ ou en comptant les foyers des protéines MutL accumulées⁴⁴. Les progrès récents dans le séquençage à haut débit ont également permis d’estimer directement les taux de mutation des trios^{parent-descendants} ⁹^,45 et multigénérations⁴⁶. Ces progrès méthodologiques commencent à permettre le comptage direct des mutations se produisant au sein d’une seule génération. Cependant, cette approche directe nécessite des technologies coûteuses et de pointe comme la microscopie par fluorescence, la microfluidique ou le séquençage du génome entier. D’autre part, l’essais de fluctuation est relativement peu coûteux et seul l’équipement de laboratoire standard est nécessaire. Faire plus d’essais de fluctuation facilitera également la génération de nouvelles hypothèses qui peuvent être testées avec des approches unicellulaires plus directes.

Il y a un intérêt de longue date dans l’étude des mutations, ainsi l’assay de fluctuation restera probablement une méthode largement utilisée. Le nombre de citations de l’article fondateur de Luria et Delbràck⁵ au cours des 4 dernières années (2015-2018) ont tous été parmi les cinq premiers pour les citations de ce document. Cependant, en raison d’une grande quantité de travail manuel précis nécessaire pour effectuer correctement un analyse de fluctuation, la plupart des études ne conduisent qu’une poignée d’essais de fluctuation. Ceci, cependant, est insuffisant pour indiquer les dépendances environnementales du taux de mutation. En rationalisant les essais de fluctuation à l’aide de plaques multipuits, comme expliqué dans cet article, le débit maximal actuel possible est de 11 plaques de puits profonds (55 essais de fluctuation) en parallèle, comme décrit ici. Exécution de deux séries de tests de fluctuation décalépar e par une journée en parallèle, permet d’effectuer jusqu’à 110 essais par semaine. Un autre changement d’étape dans le débit peut encore être possible en automatisant diverses étapes des essais de fluctuation du protocole purement manuel donné. En outre, pour étudier les dépendances environnementales du taux de mutation, la densité de population doit être prise en compte. Les résultats précédents¹⁰ montrent que lorsque les facteurs connus qui influent sur le taux de mutation sont pris en compte, le contrôle de la densité de population peut réduire la variation des estimations du taux de mutation de plus de 90 %. Pour contrôler la densité, nous recommandons que N_t (utilisé pour estimer le taux de mutation) soit déterminé indépendamment de la méthode utilisée pour déterminer la densité de population. Chez les bactéries, N_t peut être déterminé par CFU et la densité, par exemple, avec un essai de luminescence à base d’ATP¹⁰.

Un haut débit et une densité de contrôle sont tous deux essentiels pour étudier comment le contexte écologique d’un organisme affecte le taux de mutation spontanée. Il est important de connaître l’existence de la plasticité du taux de mutation, mais il est important de comprendre ses causes et ses effets sont des défis clés qui doivent être relevés si l’on veut intégrer la plasticité du taux de mutation dans un contexte biologique plus large. L’essai de fluctuation est un excellent outil qui peut être utilisé pour tester de nombreuses hypothèses, parce que les résultats sont obtenus rapidement, et les essais sont peu coûteux par rapport à d’autres méthodes. Le terrain est mis en place, par exemple, pour étudier les dépendances environnementales du taux de mutation dans les communautés bactériennes et les microbiomes. L’adaptation de l’essai de fluctuation aux cocultures peut tester l’hypothèse selon laquelle les souches influencent les taux de mutation des uns et des autres par l’intermédiaire de petites molécules. Faire des milliers d’essais de fluctuation avec des cocultures peut déterminer si les souches varient à la fois dans leur capacité à modifier les taux de mutation de l’autre et dans leur susceptibilité à avoir leur taux de mutation modifié par d’autres. Peut-être la variation parmi des souches dans la susceptibilité à la manipulation de taux de mutation est attribuable à la variation génétique spécifique. Cela pourrait transformer notre point de vue sur le fonctionnement de l’évolution dans les communautés complexes, notamment dans des exemples de grande importance tels que l’émergence de la résistance aux antimicrobiens.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RK a été soutenu par BB/M020975/1 et University of Manchester School of Biological Sciences. LES RH ont été soutenues par BB/J014478/1. GG a reçu l’appui du BBSRC Doctoral Training Partnership BB/M011208/1. DRG a été soutenu par le numéro de prix UKRI MR/R024936/1.

Materials

1.5 ml Microcentrifuge tubes	Starlab International GmbH	S1615-5550
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877-10g
6-well plates	Greiner Bio-One	REF 657102
90mm Petri Dishes Triple Vented	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)	Greiner Bio-One	REF 780270
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A/6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Bacto yeast extract	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Cycloserine	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Only for assaying an alternative phenotypic marker
D-Glucose anhydrous	Fisher Chemical	G/0500/61
50 ml Centrifuge Tube	Corning	REF 430828
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Chemical	M/1050/53
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Only for assaying an alternative phenotypic marker
Potassium phosphate dibasic trihydrate	Sigma-Aldrich	P5504-500g
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662-500g
Rifampicin	EMD Millipore Corp, USA	557303-1GM
Sodium chloride	Fisher Chemical	S/3160/60
Spectophotometer	Jenway	6320D
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Tryptone	Fisher Chemical	1278-7099

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Microbial Mutation Rates Fluctuation Assay Antibiotic Resistance Antimicrobial Resistance Monoculture Co-culture E. Coli K12 Davis Minimal Medium Glucose Optical Density Inoculum Deep Well Plate Incubation Evaporation

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Krašovec, R., Richards, H., Gomez, G., Gifford, D. R., Mazoyer, A., Knight, C. G. Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay. J. Vis. Exp. (153), e60406, doi:10.3791/60406 (2019).