Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Las dendritas son compartimentos neuronales especializados que reciben y procesan la entrada sensorial y sináptica. La compleja y estereotipada estructura de los árboles dendríticos ha estado bajo intensa investigación desde su descubrimiento. Se han establecido varios sistemas modelo, incluidas las neuronas tectales ópticas Xenopus, las células ganglionares de la retina de los polluelos y la arborización dendrítica (da) en el sistema Drosophila, para estudiar el desarrollo, la remodelación y la plasticidad de Dendritas neuronales^1,2,3,4. Las neuronas laterales ventrales drosofilia (LNvs) son un grupo de neuronas de proyección visual identificadas inicialmente por sus importantes funciones en la regulación circadiana de los comportamientos de la mosca⁵. Los estudios también revelaron el papel de los LNv larvarios como el objetivo postsináptico directo de los fotorreceptores larvarios (PR)^6,7. Es importante destacar que el cultivo de larvas en desarrollo en diferentes regímenes de luz afecta fuertemente al tamaño de los árboles dendríticos de LNvs, demostrando la idoneidad de los NL como un nuevo modelo para estudiar la plasticidad dendrítica⁷. El trabajo reciente de nuestro grupo indica además que tanto el tamaño de la dendrita LNv como el comportamiento dinámico de las ramas dendríticas muestran una plasticidad dependiente de la experiencia^8,9. Como parte de este trabajo, desarrollamos un nuevo protocolo de imagen y cuantificación en vivo para realizar análisis sobre la dinámica de dendrita de LNvs a partir de larvas^2nd o^3rd instar.

La naturaleza transparente del cerebro larvario Drosophila lo hace ideal para imágenes en vivo. Sin embargo, los árboles dendríticos de LNvs están situados en el neuropil óptico larvario (LON) densamente inervado en el centro del lóbulo cerebral larvario⁶. Para capturar imágenes de ramas finas de ndrita y filopodia en el tejido cerebral intacto, utilizamos microscopía de dos fotones, que aumenta la profundidad de penetración de la luz y reduce la fototoxicidad durante los experimentos de imágenes en vivo¹⁰. Usando esta configuración, realizamos con éxito experimentos de imágenes en vivo en LNvs durante más de 30 minutos sin observar el deterioro morfológico obvio de la neurona. Además, las manipulaciones genéticas utilizando la técnica Flip-out nos permitieron etiquetar los LNvs individuales con una membrana etiquetada GFP, que también es fundamental para monitorear los movimientos de las ramas individuales^11,12,13 .

Para capturar el comportamiento dinámico de todas las ramas en el eje dendrítico LNv con una resolución óptica óptima, realizamos imágenes 3D de lapso de tiempo en explantes cerebrales larvales recién diseccionados con una alta resolución espacial a 1 min por fotograma durante 10 a 30 min. Desarrollo de LNv las dendritas son muy dinámicas, con un gran porcentaje de las ramas que muestran cambios observables dentro de la ventana de 10 minutos. Esto conduce a uno de los principales desafíos técnicos en el estudio de la dinámica de dendrita, cuantificando el comportamiento de las ramas en función de los conjuntos de datos de imagen 4D. Los métodos previamente establecidos tienen varias limitaciones, incluyendo la falta de precisión y el requisito de tiempo excesivo. Por lo tanto, desarrollamos un método semiautomático que combina el postprocesamiento de imágenes, el marcado manual de los terminales de rama y el trazado automático de puntos 4D mediante un software de anotación de imagen. Calculamos los movimientos de los terminales de rama en diferentes puntos de tiempo en función de las coordenadas 3D de los puntos. A continuación, los datos se exportan y analizan para producir mediciones cuantitativas de la dinámica de las ramas. Este método evalúa con precisión la duración y el alcance de los eventos de extensión y retracción de las ramas existentes, así como la formación de nuevas ramas, lo que nos permite monitorear la dinámica de la dendrita en un gran número de neuronas.