Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Os dendrites são compartimentos neuronais especializados que recebem e processam a entrada sensorial e sináptica. A estrutura complexa e estereotipada de mandris dendríticos tem sido intensa investigação desde a sua descoberta. Um número de sistemas do modelo, incluindo neurônios tectal de Xenopus ótico, pilhas retinal do gânglio do pintainho, e os neurônios dendríticas da arborização (da) no sistema de Drosophila , foram estabelecidos para estudar o desenvolvimento, a remodelação e a plasticidade de dendritos neuronal^1,2,3,4. Os neurônios laterais da Drosophila ventral (lnvs) são um grupo de neurônios de projeção Visual inicialmente identificados por suas importantes funções na regulação circadiana de comportamentos de mosca⁵. Os estudos igualmente revelaram o papel de lnvs larval como o alvo pós-sináptica direto dos FOTORRECEPTORES larval (PRS)^6,7. É importante ressaltar que a cultura do desenvolvimento de larvas em diferentes regimes de luz afeta fortemente o tamanho dos mandris dendríticos do LNvs, demonstrando a adequação dos LNvs como um novo modelo para o estudo da plasticidade dendrítica⁷. O trabalho recente do nosso grupo indica ainda que tanto o tamanho do dendrito LNV quanto o comportamento dinâmico dos galhos dendríticos exibem a plasticidade dependente da experiência^8,9. Como parte deste trabalho, desenvolvemos um novo protocolo de imagem e quantificação ao vivo para realizar análises sobre a dinâmica dendrito de lnvs de larvas^{de 2 ou} 3^RD instar.

A natureza transparente do cérebro de Drosophila larval fá-lo ideal para a imagem latente viva. No entanto, os mandris dendríticos de lnvs estão situados no neurópilo óptico larval densamente inervado (lon) no centro do lobo cerebral larval⁶. Para captar imagens de galhos de dendrito finos e filopónicos no tecido cerebral intacto, utilizamos microscopia de dois fótons, o que aumenta a profundidade da penetração da luz e reduz a fototoxicidade durante experimentos de imagem ao vivo¹⁰. Usando esta configuração, realizamos com sucesso experimentos de imagem ao vivo em LNvs por mais de 30 min sem observar a deterioração morfológica óbvia do Neuron. Além disso, as manipulações genéticas utilizando a técnica flip-out permitiram-nos rotular os lnvs individuais com uma membrana etiquetada GFP, que também é fundamental para o monitoramento dos movimentos de ramos individuais^11,12,13 .

Para capturar o comportamento dinâmico de todas as filiais no mandril dendríticas de LNV com definição ótica óptima, nós executamos a imagem latente do tempo-lapso 3D em explantes de cérebro larval recentemente dissecados com uma definição espacial elevada em 1 minuto por o frame para 10 a 30 minutos. desenvolvendo LNV dendritos são altamente dinâmicos, com uma grande percentagem dos ramos exibindo mudanças observáveis dentro da janela de 10 min. Isso leva a um dos principais desafios técnicos no estudo da dinâmica dendrito, quantificando o comportamento do ramo baseado nos conjuntos de dados de imagem 4D. Os métodos previamente estabelecidos têm várias limitações, incluindo a falta da exatidão e a exigência de tempo excessiva. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um método semiautomático que combine o borne-processamento da imagem, a marcação manual dos terminais da filial, e o traçado 4D automático do ponto usando um software da anotação da imagem. Calculamos os movimentos dos terminais de filial em diferentes pontos temporais com base nas coordenadas 3D das manchas. Os dados são então exportados e analisados para produzir medições quantitativas da dinâmica da filial. Este método avalia com precisão a duração e extensão dos eventos de prorrogação e retração das ramificações existentes, bem como a formação de novos ramos, permitindo-nos monitorar a dinâmica dendrito em um grande número de neurônios.