ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳の生体調における高刺激性樹状フィロポディアの画像化に用いた方法と、デンドライトの定量的評価のためのタイムラプス3Dイメージングデータセットを定量化するために開発したプロトコルについて説明します。ニューロンの発達におけるダイナミクス。
高運動性樹状フィロポディアは、発達初期のニューロンに広く存在する。これらの探索的動的ブランチは、周囲の環境をサンプリングし、潜在的なシナプスパートナーとの接触を開始します。樹状分岐ダイナミクスとシナプトジェネシスとの関係は十分に確立されているが、発達過程と活性依存的なプロセスが樹状分岐ダイナミクスをどのように調節するかはよく理解されていない。これは、インビボシステムを使用してこれらの微細構造のライブイメージングおよび定量分析に関連する技術的な困難が原因の一部です。我々は、遺伝的アプローチを用いて個別に標識することができ、ライブイメージングのためにアクセス可能であるショウジョウバエ幼虫の心室腹部横ニューロン(LNvs)を用いてデンドライトダイナミクスを研究する方法を確立した。このシステムを利用して、タイムラプスライブイメージングを通じて、単一のラベル付きLNvの樹状樹木全体の分岐ダイナミクスを捕捉するプロトコルを開発しました。その後、ドリフト補正やデコンボリューションによる画質向上を目的とした後処理を行い、その後、全ての分岐端子の空間位置にアニズを付け、単一分岐レベルで分岐ダイナミクスを解析しました。最後に、端末トレースによって生成された座標情報を使用して分岐ダイナミクスを定量化するためのRスクリプト(補足ファイル)と特定のパラメータを開発しました。まとめると、このプロトコルは、高い時間的および空間分解能を有する神経樹状樹木樹の分岐ダイナミクスの詳細な定量的記述を達成することを可能にする。我々が開発した方法は、一般的にインビトロとインビボ条件の両方でまばらに標識されたニューロンに適用可能である。
デンドライトは、感覚入力とシナプス入力を受け取り、処理する特殊なニューロンコンパートメントです。樹状樹木の複雑でステレオタイプ化された構造は、発見以来、厳しい調査を受けています。脱視管系におけるキセノプス光学系ニューロン、ひよこ甲状腺細胞、樹状樹盤形成(da)ニューロンを含む多くのモデルシステムが、その発達、改造、可塑性を研究するために確立されている。神経デンドライト1,2,3,4.ショウジョウバエ腹部横ニューロン(LNvs)は、ハエ行動の概日調節における重要な機能について最初に同定された視覚投影ニューロンのグループである5。研究はまた、幼虫光受容体(PR)6、7の直接ポストナプティックターゲットとしての幼虫LNvsの役割を明らかにした。重要なことに、異なる光系で幼虫を発達させる培養は、LNvsの樹状樹木の樹木の大きさに強く影響を与え、樹状可塑性7を研究するための新しいモデルとしてLNvsの適合性を実証する。我々のグループからの最近の研究は、LNvデンドライトのサイズと樹状枝の動的挙動の両方が経験に依存する可塑性8、9を示すことをさらに示している。この研究の一環として、我々は新しいライブイメージングおよび定量プロトコルを開発し、2番目または3番目の幼虫からLNvsのデンドライトダイナミクスに関する分析を行った。
ショウジョウバエ幼虫脳の透明な性質は、ライブイメージングに最適です。しかし、LNvsの樹状樹木は、幼虫脳葉6の中心にある密に内来性の幼虫視神経ピル(LON)に位置している。無傷の脳組織内の微細なデンドライトの枝とフィロポディアの画像をキャプチャするために、我々は光の浸透の深さを増加させ、ライブイメージング実験10の間に光毒性を減少させる2光子顕微鏡を利用する。このセットアップを用いて、ニューロンの明らかな形態学的劣化を観察することなく、30分以上のLNvsでライブイメージング実験を行いました。さらに、フリップアウト技術を用いた遺伝子操作により、個々のLNvsにGFPというタグが付けられた膜でラベルを付け、個々の枝の動きを監視するためにも重要です11,12,13.
最適な光学分解能を持つLNv樹状樹木の全ての枝の動的挙動を捉えるために、新たに解剖された幼虫脳移植所でタイムラプス3Dイメージングを行い、フレームあたり1分間1分の高い空間分解能を10~30分間行いました。デンドライトは非常に動的であり、ブランチの大部分は10分のウィンドウ内で観察可能な変化を表示します。これは、4D画像データセットに基づいて分岐動作を定量化するデンドライトダイナミクスを研究する際の主な技術的課題の1つにつながります。以前に確立された方法には、精度の欠如や過剰な時間要件など、さまざまな制限があります。そこで、画像後処理、分岐端子の手動マーキング、画像アニテーションソフトを用いて自動4Dスポットトレースを組み合わせた半自動方式を開発しました。スポットの3D座標に基づいて、異なる時点での分岐端子の動きを計算します。その後、データがエクスポートおよび分析され、分岐ダイナミクスの定量的測定値が生成されます。この方法は、既存の分岐の延長および引き込みイベントの持続時間と範囲、および新しい分岐の形成を正確に評価し、多数のニューロンでデンドライトダイナミクスを監視することを可能にします。
ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳における個別に標識されたニューロンにおける樹状枝の動的挙動を記録し定量するために開発したプロトコルについて述べた。特に、私たちのライブイメージングプロトコルは、幼虫LNvの樹状樹木全体をキャプチャし、そのデンドライト分岐の動的状態のグローバルビューを提供することを可能にする特定のパラメータが含まれています。しかし、?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立神経障害・脳卒中研究所の内壁研究プログラム(国立衛生研究所)によって支援されています。プロジェクト番号 1ZIANS003137.
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
PBS | |||
Sucrose | |||
TES |