Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen
Özet
Hier beschreiben wir die Methode, die wir angewendet haben, um hochmotile dendritische Filopodia in einer Live-Vorbereitung des Drosophila-Larvenhirns abzubilden, und das Protokoll, das wir entwickelt haben, um Zeitraffer-3D-Bildgebungsdatensätze für quantitative Bewertungen von Dendriten zu quantifizieren. Dynamik bei der Entwicklung von Neuronen.
Abstract
Hochmotile dendritische Filopodien sind in Neuronen in frühen Entwicklungsstadien weit verbreitet. Diese explorativen dynamischen Zweige proben die Umgebung und initiieren Kontakte mit potenziellen synaptischen Partnern. Obwohl der Zusammenhang zwischen dendritischer Verzweigungsdynamik und Synaptogenese gut etabliert ist, ist nicht gut verstanden, wie entwicklungs- und aktivitätsabhängige Prozesse die dendritische Zweigdynamik regulieren. Dies ist zum Teil auf die technischen Schwierigkeiten zurückzuführen, die mit der Live-Bildgebung und quantitativen Analysen dieser feinen Strukturen mit Hilfe eines In-vivo-Systems verbunden sind. Wir haben eine Methode zur Untersuchung der Dendritendynamik mit Drosophila larval ventrallateralen Neuronen (LNvs) etabliert, die mit genetischen Ansätzen individuell gekennzeichnet werden können und für Live-Bildgebung zugänglich sind. Unter Ausnutzung dieses Systems entwickelten wir Protokolle, um die Zweigdynamik der gesamten dendritischen Laube einer einzigen markierten LNv durch Zeitraffer-Live-Bildgebung zu erfassen. Anschließend führten wir eine Nachbearbeitung durch, um die Bildqualität durch Driftkorrektur und Dekonvolution zu verbessern, gefolgt von der Analyse der Verzweigungsdynamik auf Ein-Zweig-Ebene durch Kommentieren der räumlichen Positionen aller Zweigklemmen. Schließlich haben wir R-Skripte (Supplementary File) und spezifische Parameter entwickelt, um die Verzweigungsdynamik mithilfe der von der Terminalablaufverfolgung generierten Koordinateninformationen zu quantifizieren. Zusammen genommen ermöglicht uns dieses Protokoll eine detaillierte quantitative Beschreibung der Zweigdynamik der neuronalen dendritischen Laube mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Die von uns entwickelten Methoden sind allgemein auf dünn markierte Neuronen sowohl in vitro als auch in vivo anwendbar.
Introduction
Dendriten sind spezialisierte neuronale Kompartimente, die sensorische und synaptische Eingaben empfangen und verarbeiten. Die komplexe und stereotype Struktur der dendritischen Lauben wird seit ihrer Entdeckung intensiv untersucht. Eine Reihe von Modellsystemen, einschließlich Xenopus-Optik-Tektal-Neuronen, Kichern-Retinal-Ganglienzellen und dendritischer Arborisierung (da) Neuronen im Drosophila-System, wurden eingerichtet, um die Entwicklung, Umgestaltung und Plastizität von neuronale Dendriten1,2,3,4. Drosophila ventrale Lateralneuronen (LNvs) sind eine Gruppe von visuellen Projektionneuronen, die ursprünglich für ihre wichtigen Funktionen bei der zirkadianen Regulation von Fliegenverhalten identifiziert wurden5. Studien zeigten auch die Rolle der Larven LNvs als das direkte postsynaptische Ziel der Larven photorezeptoren (PRs)6,7. Wichtig ist, dass die Kultivierung von Larven in verschiedenen Lichtregimen stark die Größe der dendritischen Lauben von LNvs beeinflusst und die Eignung von LNvs als neues Modell zur Untersuchung der dendritischen Plastizität demonstriert7. Jüngste Arbeiten unserer Gruppe deuten ferner darauf hin, dass sowohl die Größe des LNv-Dendriten als auch das dynamische Verhalten der dendritischen Zweige erfahrungsabhängige Plastizität8,9aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit entwickelten wir ein neues Live-Bildgebungs- und Quantifizierungsprotokoll, um die Dendritendynamik von LNvs aus2. oder3. Instar-Larven zu analysieren.
Die transparente Natur des Drosophila Larvenhirns macht es ideal für Live-Bildgebung. Die dendritischen Lauben von LNvs befinden sich jedoch im dicht besiedelten Larvenoptik-Neuropil (LON) in der Mitte des Larvenhirnlappens6. Um Bilder von feinen Dendritenzweigen und Filopodia im intakten Hirngewebe zu erfassen, verwenden wir eine Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die Tiefe der Lichtdurchdringung erhöht und die Phototoxizität bei Live-Bildgebungsexperimenten10reduziert. Mit diesem Setup führten wir erfolgreich Live-Bildgebungsexperimente auf LNvs über 30 min durch, ohne eine offensichtliche morphologische Verschlechterung des Neurons zu beobachten. Darüber hinaus ermöglichten uns genetische Manipulationen mit der Flip-out-Technik die Kennzeichnung der einzelnen LNvs mit einer Membran mit gfP-Kennzeichnung, die auch für die Überwachung der Bewegungen einzelner Zweige entscheidend ist11,12,13 .
Um das dynamische Verhalten aller Zweige auf der Dendritischen Laube LNv mit optimaler optischer Auflösung zu erfassen, führten wir Zeitraffer-3D-Bildgebung an frisch sezierten Larvenhirn-Explants mit einer hohen räumlichen Auflösung bei 1 min pro Frame für 10 bis 30 min durch. Dendriten sind hochdynamisch, wobei ein großer Prozentsatz der Zweige beobachtbare Änderungen innerhalb des 10-min-Fensters anzeigt. Dies führt zu einer der wichtigsten technischen Herausforderungen bei der Untersuchung der Dendritendynamik, der Quantifizierung des Zweigverhaltens auf Basis der 4D-Bilddatensätze. Zuvor etablierte Methoden haben verschiedene Einschränkungen, einschließlich mangelnder Genauigkeit und übermäßiger Zeitanforderung. Daher haben wir eine halbautomatische Methode entwickelt, die die Bildnachbearbeitung, die manuelle Markierung der Verzweigungsklemmen und die automatische 4D-Spotverfolgung mit einer Bildanmerkungssoftware kombiniert. Wir berechnen die Bewegungen von Zweigklemmen zu verschiedenen Zeitpunkten basierend auf den 3D-Koordinaten der Spots. Die Daten werden dann exportiert und analysiert, um quantitative Messungen der Branchendynamik zu erstellen. Diese Methode bewertet genau die Dauer und das Ausmaß der Verlängerungs- und Rückzugsereignisse bestehender Zweige sowie die Bildung neuer Zweige, so dass wir die Dendritendynamik in einer großen Anzahl von Neuronen überwachen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das wir entwickelt haben, um das dynamische Verhalten dendritischer Zweige in individuell gekennzeichneten Neuronen in Drosophila Larvengehirnen aufzuzeichnen und zu quantifizieren. Insbesondere enthält unser Live-Imaging-Protokoll spezifische Parameter, die es uns ermöglichen, die gesamte dendritische Arbor eines Larven-LNv zu erfassen und einen globalen Überblick über den dynamischen Zustand seiner Dendritenzweige zu geben. Da unsere Quantifizierungsmethoden jedoch stark…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird vom Intramural Research Program des National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, unterstützt. Projektnummer 1ZIANS003137.
Materials
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES | |||
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