Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d’imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.
La filodée dendritique très motile est largement présente dans les neurones aux premiers stades de développement. Ces branches dynamiques exploratoires échantillonnent l’environnement environnant et amorceront des contacts avec des partenaires synaptiques potentiels. Bien que le lien entre la dynamique des branches dendritiques et la synaptogénèse soit bien établi, la façon dont les processus développementaux et dépendants de l’activité régulent la dynamique des branches dendritiques n’est pas bien comprise. Cela est dû en partie aux difficultés techniques associées à l’imagerie en direct et aux analyses quantitatives de ces structures fines à l’aide d’un système in vivo. Nous avons établi une méthode pour étudier la dynamique des dendrites à l’aide des neurones larvaires ventrals de Drosophila (LNvs), qui peuvent être étiquetés individuellement à l’aide d’approches génétiques et sont accessibles pour l’imagerie en direct. Profitant de ce système, nous avons développé des protocoles pour capturer la dynamique des branches de toute l’arborescence dendritique d’un seul LNv étiqueté grâce à l’imagerie en direct en accéléré. Nous avons ensuite effectué le post-traitement pour améliorer la qualité de l’image par la correction de la dérive et la déconvolution, puis par l’analyse de la dynamique des branches au niveau d’une seule branche en annoté les positions spatiales de tous les terminaux de branche. Enfin, nous avons développé des scripts R(Fichier supplémentaire) et des paramètres spécifiques pour quantifier la dynamique des branches à l’aide des informations de coordonnées générées par le suivi terminal. Collectivement, ce protocole nous permet d’obtenir une description quantitative détaillée de la dynamique des branches de l’arborescence neuronale dendritique avec une haute résolution temporelle et spatiale. Les méthodes que nous avons développées sont généralement applicables aux neurones peu étiquetés dans des conditions in vitro et in vivo.
Les dendrites sont des compartiments neuronaux spécialisés qui reçoivent et traitent l’entrée sensorielle et synaptique. La structure complexe et stéréotypée des arborescences dendritiques fait l’objet d’une intense enquête depuis leur découverte. Un certain nombre de systèmes modèles, y compris les neurones tecattiques optiques Xenopus, les cellules ganglionnaires rétiniennes de poussins et les neurones d’arborescence dendritique (da) dans le système Drosophila, ont été mis en place pour étudier le développement, le remodelage et la plasticité des dendrites neuronales1,2,3,4. Les neurones latéraux ventral de Drosophila (LNvs) sont un groupe de neurones de projection visuelle initialement identifiés pour leurs fonctions importantes dans la régulation circadienne des comportements de mouche5. Des études ont également révélé le rôle des LNv larvaires comme cible postsynaptique directe des photorécepteurs larvaires (PR)6,7. Il est important de noter que la culture de larves en développement dans différents régimes de lumière affecte fortement la taille des arborescences dendritiques de LNvs, démontrant l’adéquation des LNvs en tant que nouveau modèle pour l’étude de la plasticité dendritique7. Les travaux récents de notre groupe indiquent en outre que la taille de la dendrite LNv et le comportement dynamique des branches dendritiques affichent l’expérience-dépendance plasticité8,9. Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un nouveau protocole d’imagerie et de quantification en direct pour effectuer des analyses sur la dynamique dendrite des LNv à partir de 2nd ou 3rd instar larves.
La nature transparente du cerveau larvaire Drosophila le rend idéal pour l’imagerie en direct. Cependant, les arborescences dendritiques des LNv sont situées dans le neuropil optique larvaire densément innervé (LON) au centre du lobe du cerveau larvaire6. Pour capturer des images de branches fines de dendrite et de filopodia dans le tissu cérébral intact, nous utilisons la microscopie à deux photons, qui augmente la profondeur de pénétration de la lumière et réduit la phototoxicité lors d’expériences d’imagerie en direct10. En utilisant cette configuration, nous avons effectué avec succès des expériences d’imagerie en direct sur les LNv pendant plus de 30 min sans observer la détérioration morphologique évidente du neurone. En outre, les manipulations génétiques utilisant la technique Flip-out nous ont permis d’étiqueter les LNvs individuels avec une membrane marquée GFP, qui est également critique pour surveiller les mouvements des branches individuelles11,12,13 .
Pour capturer le comportement dynamique de toutes les branches de l’arborescence dendritique LNv avec une résolution optique optimale, nous avons effectué l’imagerie 3D time-lapse sur des explants de cerveau larvaire fraîchement disséqués avec une haute résolution spatiale à 1 min par cadre pendant 10 à 30 min. Développer LNvv. Les dendrites sont très dynamiques, avec un grand pourcentage des branches affichant des changements observables dans la fenêtre de 10 min. Cela conduit à l’un des principaux défis techniques dans l’étude de la dynamique des dendrites, quantifiant le comportement des branches à partir des ensembles de données d’image 4D. Les méthodes précédemment établies ont diverses limitations, y compris le manque d’exactitude et l’exigence excessive de temps. Par conséquent, nous avons développé une méthode semi-automatique qui combine le post-traitement d’image, le marquage manuel des terminaux de branche, et le traçage 4D automatique de tache utilisant un logiciel d’annotation d’image. Nous calculons les mouvements des terminaux de branche à différents points de temps en fonction des coordonnées 3D des taches. Les données sont ensuite exportées et analysées pour produire des mesures quantitatives de la dynamique des branches. Cette méthode évalue avec précision la durée et l’étendue des événements d’extension et de rétraction des branches existantes, ainsi que la formation de nouvelles branches, ce qui nous permet de surveiller la dynamique des dendrites dans un grand nombre de neurones.
Ici, nous décrivons un protocole que nous avons développé pour enregistrer et quantifier le comportement dynamique des branches dendritiques dans les neurones individuellement étiquetés dans les cerveaux larvaires de Drosophila. Notamment, notre protocole d’imagerie en direct contient des paramètres spécifiques qui nous permettent de capturer l’ensemble de l’arborescence dendritique d’un LNv larvaire et de fournir une vue globale de l’état dynamique de ses branches dendrite. Cependant, parce que nos mét…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par le Programme de recherche intra-muros de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux, National Institutes of Health. Numéro de projet 1ZIANS003137.
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
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