Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.
Zeer beweeglijke dendritische filopodia zijn op grote schaal aanwezig in neuronen in vroege ontwikkelingsstadia. Deze verkennende dynamische takken proeven de omgeving en initiëren contacten met potentiële synaptische partners. Hoewel de verbinding tussen dendritische tak dynamiek en synaptogenese is goed vastgesteld, hoe ontwikkelings-en activiteitsafhankelijke processen reguleren dendritische tak dynamiek is niet goed begrepen. Dit is deels te wijten aan de technische moeilijkheden in verband met de Live beeldvorming en kwantitatieve analyses van deze fijne constructies met behulp van een in vivo systeem. We hebben een methode opgezet om dendriet-dynamiek te bestuderen met behulp van Drosophila larvale ventrale laterale neuronen (Lnv’s), die individueel kunnen worden geëtiketteerd met behulp van genetische benaderingen en toegankelijk zijn voor Live beeldvorming. Door gebruik te maken van dit systeem hebben we protocollen ontwikkeld om de tak dynamiek van de hele dendritische Arbor van één gelabeld LNv te veroveren door middel van time-lapse Live beeldvorming. Vervolgens hebben we nabewerking uitgevoerd om de beeldkwaliteit te verbeteren door middel van drift correctie en deconvolutie, gevolgd door het analyseren van de vertakkings dynamiek op het single-Branch niveau door de ruimtelijke posities van alle filiaal terminals te annoveren. Ten slotte ontwikkelden we R-scripts (aanvullend bestand) en specifieke parameters om de vertakkings dynamiek te kwantificeren met behulp van de coördinaten informatie die wordt gegenereerd door de Terminal tracering. Collectief, dit protocol stelt ons in staat om een gedetailleerde kwantitatieve beschrijving van de tak dynamiek van de neuronale dendritische Arbor met hoge temporele en ruimtelijke resolutie te bereiken. De methoden die we ontwikkelden zijn over het algemeen toepasbaar op dungelabelde neuronen in zowel in vitro als in vivo condities.
Dendrites zijn gespecialiseerde neuronale compartimenten die ontvangen en verwerken van sensorische en synaptische input. De complexe en stereotiepe structuur van dendritische Arbors is sinds hun ontdekking intensief onderzocht. Een aantal modelsystemen, waaronder Xenopus optische tectale neuronen, Chick retinale ganglioncellen en dendritische arborization (da) neuronen in het Drosophila systeem, zijn opgericht om de ontwikkeling, verbouwing en plasticiteit van neuronale dendrites1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuronen (Lnv’s) zijn een groep visuele projectie neuronen die aanvankelijk werden geïdentificeerd voor hun belangrijke functies in de circadiane regulatie van vlieggedrag5. Studies onthulde ook de rol van larvale lnvs als de directe postsynaptische doelstelling van de larvale fotoreceptoren (PRS)6,7. Belangrijk is dat het kweken van larven in verschillende licht regimes sterk van invloed is op de grootte van Lnv’s ‘ dendritische Arbors, die de geschiktheid van LNvs aantonen als een nieuw model voor het bestuderen van dendritische plasticiteit7. Recent werk van onze groep wijst er verder op dat zowel de grootte van de LNV dendriet als het dynamische gedrag van de dendritische takken ervaring-afhankelijke plasticiteit weergeven8,9. Als onderdeel van dit werk ontwikkelden we een nieuw live beeld-en kwantificerings protocol om analyses uit te voeren over de dendriet-dynamiek van Lnv’s van 2ND of 3RD instar larven.
De transparante aard van de hersenen Drosophila larvale maakt het ideaal voor Live beeldvorming. Echter, de dendritische Arbors van lnvs bevinden zich in de dichtbevolkte larvale optische neuropil (LON) in het midden van de larvale hersenen kwab6. Om beelden van fijne dendriet takken en filopodia in het intacte hersenweefsel vast te leggen, gebruiken we twee-photon microscopie, die de diepte van licht penetratie verhoogt en de fototoxiciteit vermindert tijdens Live Imaging experimenten10. Met behulp van deze instellingen hebben we met succes Live Imaging experimenten uitgevoerd op Lnv’s voor meer dan 30 minuten zonder de duidelijke morfologische verslechtering van het neuron te observeren. Bovendien hebben genetische manipulaties met behulp van de flip-out techniek ons in staat om de individuele lnv’s te labelen met een membraan gelabeld GFP, dat ook cruciaal is voor het bewaken van de bewegingen van individuele takken11,12,13 .
Om het dynamische gedrag van alle takken op de LNv dendritische Arbor met optimale optische resolutie vast te leggen, hebben we time-lapse 3D-beeldvorming uitgevoerd op vers ontleed larvale hersen explanten met een hoge ruimtelijke resolutie op 1 min per frame voor 10 tot 30 min. ontwikkelen van LNv dendrites zijn zeer dynamisch, met een groot percentage van de takken weergegeven waarneembare veranderingen binnen de 10 min venster. Dit leidt tot een van de belangrijkste technische uitdagingen bij het bestuderen van dendriet-dynamiek, het kwantificeren van vertakkings gedrag op basis van de 4D-beeldgegevens sets. Eerder vastgestelde methoden hebben verschillende beperkingen, waaronder gebrek aan nauwkeurigheid en buitensporige tijd vereiste. Daarom hebben we een semi-automatische methode ontwikkeld die de nabewerking van afbeeldingen, handmatige markering van de aftakkingen van de filialen en automatische 4D-spot tracering met behulp van een afbeelding aantekening software combineert. We berekenen de bewegingen van de filialen op verschillende tijdstippen op basis van de 3D-coördinaten van de spots. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd en geanalyseerd om kwantitatieve metingen van de vertakkings dynamiek te produceren. Deze methode beoordeelt nauwkeurig de duur en omvang van de uitbreiding en terugtrekking gebeurtenissen van bestaande takken, evenals de vorming van nieuwe takken, waardoor we de dendriet dynamiek in een groot aantal neuronen bewaken.
Hier beschrijven we een protocol dat we hebben ontwikkeld om het dynamische gedrag van dendritische takken in individueel gelabelde neuronen in Drosophila larvale hersenen op te nemen en te kwantificeren. Met name ons Live Imaging protocol bevat specifieke parameters die ons in staat stellen om het hele dendritische prieel van een larvale LNV vast te leggen en een globaal beeld te bieden van de dynamische toestand van haar dendriet takken. Omdat onze kwantificeringsmethoden echter sterk afhankelijk zijn van de a…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte, National Institutes of Health. Project nummer 1ZIANS003137.
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
PBS | |||
Sucrose | |||
TES |