在这里,我们描述了我们用于在果蝇幼虫脑活制备中成像高度多瓣树突状丝虫的方法,以及我们为量化延时三维成像数据集用于对树突进行定量评估的协议发展神经元的动态。
在早期发育阶段的神经元中广泛存在高莫性树突状纤维化。这些探索性动态分支对周围环境进行采样,并启动与潜在突触伙伴的接触。虽然树突状分支动力学和突触发生之间的联系已经确立,但发育和活动依赖过程如何调节树突状分支动力学还没有得到很好的理解。这部分是由于使用体内系统对这些精细结构进行实时成像和定量分析相关的技术困难。我们建立了一种使用果蝇幼虫幼虫腹侧神经元(LNvs)研究树突动力学的方法,这种神经元可以使用遗传方法单独标记,并可用于活成像。利用这个系统,我们开发了协议,通过延时实时成像捕获单个标记 LNv 的整个树突状树突动力学。然后,我们执行后处理,通过漂移校正和递减来提高图像质量,然后通过批注所有分支终端的空间位置来分析单分支级别的分支动力学。最后,我们开发了R脚本(补充文件)和特定参数,利用终端跟踪生成的坐标信息量化分支动力学。总体而言,该协议允许我们实现具有高时空分辨率的神经元树突状树突动力学的详细定量描述。我们开发的方法通常适用于体外和体内条件下标记稀疏的神经元。
树突是接收和处理感觉和突触输入的专用神经元隔间。树突状树丛的复杂和定型结构自发现以来一直在进行紧张的研究。已经建立了许多模型系统,包括Xenopus视性神经神经元、小鸡视网膜神经细胞和果蝇体内的树突化(da)神经元,以研究Drosophila系统的发育、重塑和可塑性。神经元树突1,2,3,4 。果蝇腹腔侧神经元(LNvs)是一组视觉投影神经元,最初被确定为在昼夜调节苍蝇行为5中的重要功能。研究还表明,幼虫LNvs作为幼虫光受体(PRs)6、7的直接后发贴靶点的作用。重要的是,培养不同光基培养的幼虫会强烈地影响LNvs的树突状树突状树突的大小,表明LNvs作为研究树突可塑性的新模型是适宜的。我们小组最近的工作进一步表明,LNv树突的大小和树突分支的动态行为都表现出经验依赖性的可塑性8,9。作为这项工作的一部分,我们开发了一种新的活成像和定量协议,以对从星幼虫的第2或第3代LNvs的树突动力学进行分析。
果蝇幼虫大脑的透明特性使其成为活成像的理想选择。然而,LNvs的树突状树干位于幼虫脑叶6中心密集内垂的幼虫光神经桩(LON)。为了捕捉完好的脑组织中细的树突分支和丝波多迪亚的图像,我们采用双光子显微镜,在活成像实验中增加光穿透深度,降低光毒性。利用此设置,我们在 LNvs 上成功进行了超过 30 分钟的实时成像实验,但没有观察到神经元的明显形态恶化。此外,使用翻转技术进行的基因操作使我们能够用标有GFP的膜标记单个LNvs,这对于监测单个分支11、12、13的运动也至关重要。.
为了以最佳的光学分辨率捕捉 LNv 树突状树突上所有分支的动态行为,我们对刚解剖的幼虫脑外移进行了延时 3D 成像,每帧 1 分钟,空间分辨率高,为 10 到 30 分钟。树突是高度动态的,在 10 分钟窗口内,很大一部分分支显示可观察到的变化。这导致在研究树突动力学方面面临的主要技术挑战之一,根据 4D 图像数据集量化分支行为。以前建立的方法存在各种限制,包括缺乏准确性和时间要求过高。因此,我们开发了一种半自动方法,结合图像后处理、分支终端的手动标记和图像注释软件的自动4D点跟踪。我们根据点的 3D 坐标计算分支终端在不同时间点的移动。然后导出和分析数据,以生成分支动力学的定量测量。该方法准确评估现有分支的扩展和回缩事件的持续时间和范围,以及新分支的形成,使我们能够监测大量神经元的树突动力学。
在这里,我们描述了我们开发的一个协议,用于记录和量化树突状分支在果蝇幼虫大脑中单独标记的神经元的动态行为。值得注意的是,我们的实时成像协议包含特定的参数,使我们能够捕获幼虫LNv的整个树突状树突,并提供其树突分支动态状态的全局视图。然而,由于我们的定量方法严重依赖分支终端的注释,具有复杂树突结构和浓缩树的神经元不适合进行这种分析。
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院神经疾病和中风研究所内部研究计划的支持。项目编号 1ZIANS003137。
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
PBS | |||
Sucrose | |||
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