Obtention de vésicules hybrides Unilamellar géantes par électroformation et mesure de leurs propriétés mécaniques par Micropipette Aspiration
Özet
L’objectif du protocole est de mesurer de façon fiable les propriétés mécaniques membranaires des vésicules géantes par aspiration micropipette.
Abstract
Les vésicules géantes obtenues à partir de phospholipides et de copolymères peuvent être exploitées dans différentes applications : livraison contrôlée et ciblée de médicaments, reconnaissance biomoléculaire au sein des biocapteurs pour le diagnostic, membranes fonctionnelles pour les cellules artificielles et développement de micro/nanoréacteurs bioinspirés. Dans toutes ces applications, la caractérisation de leurs propriétés membranaires est d’une importance fondamentale. Parmi les techniques de caractérisation existantes, l’aspiration micropipette, lancée par E. Evans, permet de mesurer les propriétés mécaniques de la membrane telles que le modulus de compressibilité de zone, le modulus de flexion et le stress et la contrainte de lyse. Ici, nous présentons toutes les méthodologies et procédures détaillées pour obtenir des vésicules géantes à partir de la fine pellicule d’un lipide ou d’un copolymère (ou les deux), la fabrication et le traitement de surface des micropipettes, et la procédure d’aspiration menant à la mesure de tous les paramètres mentionnés précédemment.
Introduction
Les vésicules géantes obtenues à partir de phospholipides (liposomes) ont été largement utilisés depuis les années 1970 comme modèle de membrane cellulaire de base1. À la fin des années 1990, les morphologies vésiculaires obtenues à partir de l’auto-assemblage de copolymères, nommés polymères en référence à leurs analogues lipidiques2,3, sont rapidement apparus comme une alternative intéressante aux liposomes qui possèdent une faible stabilité mécanique et une faible fonctionnalité chimique modulaire. Cependant, leur caractère biomimétique cellulaire est plutôt limité par rapport aux liposomes puisque ces derniers sont composés de phospholipides, la principale composante de la membrane cellulaire. En outre, leur perméabilité à faible membrane peut être un problème dans certaines applications comme la livraison de médicaments où la diffusion contrôlée des espèces à travers la membrane est nécessaire. Récemment, l’association des phospholipides avec des copolymères de bloc pour concevoir les vésicules et membranes hybrides polymères-lipidiques a fait l’objet d’un nombre croissant d’études4,5. L’idée principale est de concevoir des entités qui combinent en synergie les avantages de chaque composant (biofonctionnalité et perméabilité des bicouches lipidiques avec la stabilité mécanique et la polyvalence chimique des membranes polymères), qui peuvent être exploitées dans différentes applications : livraison contrôlée et ciblée de médicaments, reconnaissance biomoléculaire au sein des biocapteurs pour le diagnostic, membranes fonctionnelles pour les cellules artificielles, développement de micro-réacteurs bio-inspirés.
Aujourd’hui, différentes communautés scientifiques (biochimistes, chimistes, biophysiciens, physico-chimistes, biologistes) s’intéressent de plus en plus au développement d’un modèle de membrane cellulaire plus avancé. Ici, notre objectif est de présenter, aussi détaillées que possible, des méthodologies existantes (électroformation, aspiration micropipette) pour obtenir et caractériser les propriétés mécaniques des vésicules géantes et les récents modèles de membrane cellulaire ” avancé ” qui sont des vésicules géantes hybrides de lipides polymères4,5.
Le but de ces méthodes est d’obtenir une mesure fiable de la compressibilité de la zone et la flexion moduli de la membrane ainsi que leur stress de lyse et de la souche. Une des techniques les plus courantes existantes pour mesurer la rigidité de flexion d’une vésicule géante est l’analyse de fluctuation6,7, basée sur l’observation vidéo directe de microscope ; mais cela nécessite une grande fluctuation visible de la membrane, et n’est pas systématiquement obtenu sur des membranes épaisses (par exemple polymères). Le modulus de compressibilité de zone peut être expérimentalement déterminé utilisant la technique de Langmuir Blodgett mais le plus souvent sur un monolayer8. La technique d’aspiration de micropipette permet la mesure des deux moduli sur une bicouche formant la vésicule unilamellar géante (GUV) dans une expérience.
La méthode suivante est appropriée pour toutes les molécules amphiphiles ou macromolécules capables de former des bicouches et, par conséquent, des vésicules par électroformation. Cela nécessite un caractère fluide de la bicouche à la température de l’électroformation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le revêtement de la micropipette est l’un des points clés pour obtenir des mesures fiables. L’adhérence de la vésicule à la micropipette doit être évitée, et un revêtement est couramment utilisé dans la littérature17,18,19,20,21, avec BSA, ‘-caséine ou surfasil. Les détails de la procédure de revêtement sont rarement mentionnés.
<p class="j…Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient l’ANR pour son soutien financier (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
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