Özet

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

Published: January 19, 2020
doi:

Özet

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Abstract

Vesículas gigantes obtidas a partir de fosfolípidos e polímeros podem ser exploradas em diferentes aplicações: entrega de medicamentos controlados e direcionados, reconhecimento biomolecular dentro de biossensores para diagnóstico, membranas funcionais para células artificiais e desenvolvimento de micro/nanores bioinspirados. Em todas essas aplicações, a caracterização de suas propriedades de membrana é de fundamental importância. Entre as técnicas de caracterização existentes, a aspiração micropipette, pioneira por E. Evans, permite a medição de propriedades mecânicas da membrana, como modulus de compresibilidade de área, modulus de flexão e estresse e tensão de lise. Aqui, apresentamos todas as metodologias e procedimentos detalhados para obter vesículas gigantes a partir da película fina de um lipídico ou copolímero (ou ambos), a fabricação e o tratamento superficial de micropipettes e o procedimento de aspiração que leva à medição de todos os parâmetros mencionados anteriormente.

Introduction

Vesículas gigantes obtidas a partir de fosfolípidos (lipossomos) têm sido amplamente utilizados desde a década de 1970 como o modelo de membrana celular básica1. No final da década de 1990, as morfologias vesiculares obtidas a partir da automontagem de copolímeros, denominadas polimerasias em referência aos seus análogos lipídicos2,3, rapidamente apareceram como uma alternativa interessante aos lipossomas que possuem estabilidade mecânica fraca e má funcionalidade química modular. No entanto, seu caráter biomimético celular é bastante limitado em comparação com os lipossomos, uma vez que estes últimos são compostos de fosfolípidos, o principal componente da membrana celular. Além disso, sua baixa permeabilidade da membrana pode ser um problema em algumas aplicações, como a entrega de drogas, onde a difusão controlada de espécies através da membrana é necessária. Recentemente, a associação de fosfolípidos com polímeros de bloco para projetar vesículas e membranas polímeras-lipídios híbridas tem sido objeto de um número crescente de estudos4,5. A idéia principal é projetar entidades que combinam sinergicamente os benefícios de cada componente (biofuncionalidade e permeabilidade de bicamadas lipídicas com a estabilidade mecânica e versatilidade química das membranas polímeras), que podem ser exploradas em diferentes aplicações: entrega de medicamentos controlados e direcionados, reconhecimento biomolecular dentro de biossensores para diagnóstico, membranas funcionais para células artificiais, desenvolvimento de micro/nano-reatores de inspiração biológica.

Hoje em dia, diferentes comunidades científicas (bioquímicos, químicos, biofísicos, químicos-físicos, biólogos) têm um interesse crescente no desenvolvimento de um modelo de membrana celular mais avançado. Aqui, nosso objetivo é apresentar, o mais detalhado possível, metodologias existentes (eletroformação, aspiração micropipette) para obter e caracterizar as propriedades mecânicas das vesículas gigantes e os recentes modelos de membrana celular “avançada” que são vesículas gigantes lipídicas de polímero híbrido4,5.

O objetivo desses métodos é obter medição confiável da compresibilidade da área e moduli de flexão da membrana, bem como seu estresse e tensão de lyse. Uma das técnicas mais comuns existentes para medir a rigidez de flexão de uma vesícula gigante é a análise de flutuação6,7,com base na observação direta do microscópio de vídeo; mas isso requer grande flutuação visível da membrana, e não é sistematicamente obtido em membranas espessas (por exemplo, polimémersos). Modulus de compresibilidade de área pode ser determinada experimentalmente usando a técnica Langmuir Blodgett, mas na maioria das vezes em um monocamada8. A técnica de aspiração micropipette permite a medição de ambos moduli em um bicamada formando vesícula unilamellar gigante (GUV) em um experimento.

O seguinte método é apropriado para todas as moléculas ou macromoléculas anfofílicas capazes de formar bicamadas e, consequentemente, vesículas por eletroformação. Isso requer um caráter fluido do bicamada à temperatura da eletroformação.

Protocol

1. Fabricação de micropipettes NOTA: Aqui, micropipettes com um diâmetro interno que variam de 6 a 12 μm e um comprimento de cone em torno de 3-4 mm são necessários. Um método detalhado de fabricação de micropipette é descrito no seguinte. Coloque o capilar de vidro borosilicato na barra de desenho do puxador e corrigir uma das extremidades, apertando o botão. Cuidadosamente deslize o vidro através dos buracos ao lado da câmara do aquecedor. Aperte o …

Representative Results

Com o protocolo acima mencionado, estudamos diferentes vesículas unilamellares sintéticas (GUV), obtidas a partir de um fosfolípido: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (POPC), um polímero tribloco: Poli (etileóxido)-b-Poly (dimetilsiloxane) -b-Poly (etilenoóxido) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) sintetizado em um estudo anterior13, e um diblock copolímero Poly (dimetilsiloxane) …

Discussion

O revestimento da micropipette é um dos pontos-chave para obter medições confiáveis. A adesão da vesícula à micropipette deve ser evitada, e um revestimento é comumente usado na literatura17,18,19,20,21,com BSA, β-casein ou surfasil. Detalhes do procedimento de revestimento raramente são mencionados.

A dissolução da BSA …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem com gratidão a ANR pelo apoio financeiro (ANR Sysa).

Materials

Required equipment and materials for micropipette design
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4 external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.
Filament installed Sutter Instrument Co. FB255B 2.5mm*2.5mm Box Filament
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Microforge NARISHGE Co. MF-900 fitted with two objectives (10x and 32x)
Materials for coating pipette tips with BSA
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) Sigma-Aldrich 10735078001
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
Disposable 10 ml syringe Luer Tip Codan 626616
Disposable 5 ml syringe Luer Tip Codan 62.5607
Disposable acetate cellulose filter Cluzeau Info Labo L5003SPA Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm
Flexible Fused Silica Capillary Tubing Polymicro Technologies. TSP530660 Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm,
Glucose Sigma-Aldrich G5767
Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT Hamilton Syringe Company 1750
Test tube rotatory mixer Labinco 28210109
Micromanipulation Set up
Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series Newport
Damped Optical Table Newport used as support of microscope to prevent external vibrations.
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP 2 The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.
Micrometer Mitutoyo Corporation 350-354-10 Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm
Plexiglass water reservoir (100 ml) Home made
TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). Leica
X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread Newport
Materials for sucrose and amphiphile solution preparation
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Sigma-Aldrich
Chloroform VWR 22711.244
L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) Sigma-Aldrich 810146C Rhodamine tagged lipid
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Electroformation set up
10 µL glass capillary ringcaps Hirschmann 9600110
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
H Grease Apiezon Apiezon H Grease Silicon-free grease
Indium tin oxide coated glass slides Sigma-Aldrich 703184
Needle Terumo AN2138R1 0.8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimeter) Voltcraft VC140
Toluene VWR 28676.297
Voltage generator Keysight 33210A

Referanslar

  1. Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
  2. Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
  3. Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
  4. Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
  5. Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
  6. Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
  7. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
  8. Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
  9. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  10. Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
  11. Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
  12. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  13. Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
  14. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
  15. Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
  16. Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
  17. Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
  18. Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
  19. Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
  20. Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
  21. Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
  22. Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ibarboure, E., Fauquignon, M., Le Meins, J. Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration. J. Vis. Exp. (155), e60199, doi:10.3791/60199 (2020).

View Video