Özet

امتصاص الحويصلات الهجينة العملاقة أحاديه الجانب بالكهرباء وقياس خواصها الميكانيكية من خلال شفط الماصات المجهرية

Published: January 19, 2020
doi:

Özet

والهدف من البروتوكول هو قياس الخواص الميكانيكية الغشائية للحويصلات العملاقة بشكل موثوق من خلال شفط الماصة المجهرية.

Abstract

ويمكن استغلال الحويصلات العملاقة التي يتم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية والبوليمرات في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والاعتراف بالجزيئات الحيوية في التشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير مفاعلات مجهريه/نانو. في جميع هذه التطبيقات ، وتوصيف خصائص غشاء لها اهميه أساسيه. ومن بين تقنيات التوصيف الحالية ، فان طموح الماصة المجهرية ، الذي كان رائدا من قبل e. ايفانز ، يسمح بقياس الخواص الميكانيكية لغشاء مثل معامل انضغاط المنطقة ، ومعامل الانحناء ، والإجهاد تحلل والسلالة. هنا ، نقدم جميع المنهجيات والإجراءات التفصيلية للحصول علي حويصلات عملاقه من الغشاء الرقيق للدهون أو البوليمرات (أو كليهما) ، والتصنيع والمعالجة السطحية من الماصات الدقيقة ، والاجراء الطموح الذي يؤدي إلى قياس جميع المعلمات المذكورة سابقا.

Introduction

الحويصلات العملاقة التي تم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية (الدهنية) وقد استخدمت علي نطاق واسع منذ 1970s كنموذج غشاء الخلية الاساسيه1. في أواخر 1990s ، التي تم الحصول عليها من التجميع الذاتي من البوليمرات النحاسية ، اسمه بوليميرسوميس في اشاره إلى نظيره الدهون2،3، ظهرت بسرعة كبديل مثيره للاهتمام للدهنيات التي تمتلك الاستقرار الميكانيكية ضعيفه والفقراء وظائف الكيميائية وحدات. ومع ذلك ، فان الطابع الحيوي للخلية الخاصة بهم محدوده بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية لان الاخيره تتكون من الدهون الفوسفاتية ، المكون الرئيسي لغشاء الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان نفاذيه غشاء منخفضه يمكن ان يكون مشكله في بعض التطبيقات مثل تسليم المخدرات حيث الانتشار الخاضع للرقابة من الأنواع من خلال الغشاء مطلوب. في الاونه الاخيره ، كانت جمعيه الفوسفورية مع كتله البوليمرات لتصميم الهجينة البوليمر الدهون الحويصلات والاغشيه موضوعا لعدد متزايد من الدراسات4،5. الفكرة الرئيسية هي لتصميم الكيانات التي تازر الجمع بين فوائد كل مكون (الوظائف الحيوية ونفاذيه الطبقات الدهنية مع الاستقرار الميكانيكي وبراعة الكيميائية من اغشيه البوليمر) ، والتي يمكن استغلالها في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والتعرف علي الجزيئات الحيوية داخل الخلايا البيولوجية للتشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير المجهرية مستوحاه من بيو-/نانوسوتوريس.

في الأيام الحالية ، المجتمعات العلمية المختلفة (الكيمياء الحيوية ، الكيميائيين ، الصيدلة البيولوجية ، الفيزيائية الكيميائية ، علماء الاحياء) لديها اهتمام متزايد في تطوير نموذج غشاء الخلية أكثر تقدما. هنا ، هدفنا هو تقديم ، علي النحو المفصل بقدر الإمكان ، المنهجيات الموجودة (الكهرباء ، شفط الماصات الدقيقة) للحصول علي وتوصيف الخواص الميكانيكية للحويصلات العملاقة ونماذج غشاء الخلية “المتقدمة” الاخيره التي هي الهجين البوليمر الدهون العملاقة حويصلات4

والغرض من هذه الأساليب هو الحصول علي قياس موثوق بها للضغط المنطقة والانحناء بلتيير من الغشاء ، فضلا عن الإجهاد تحلل وسلاله. واحده من التقنيات الأكثر شيوعا الموجودة لقياس صلابة الانحناء من حويصلة عملاقه هو تذبذب تحليل6،7، استنادا إلى مراقبه المجهر الفيديو المباشر ؛ ولكن هذا يتطلب تذبذبا كبيرا في الغشاء المرئي ، ولا يتم الحصول عليه بشكل منتظم علي الاغشيه السميكة (مثل بوليميرسوميس). يمكن تحديد معامل الانضغاط المنطقة بالتجربة باستخدام تقنيه لانموير بلودغيت ولكن في معظم الأحيان علي أحادي الطبقة8. تسمح تقنيه شفط الماصات المجهرية بقياس كل من التحوير علي طبقه ثنائيه تشكل الحويصلة الاحاديه العملاقة (GUV) في تجربه واحده.

الطريقة التالية مناسبه لجميع الجزيئات البرمائية أو الجزيئات قادره علي تشكيل الطبقات الثنائية ، التالي ، حويصلات بالكهرباء. وهذا يتطلب طابعا سائلا من الطبقة الثنائية عند درجه حرارة الكهرباء.

Protocol

1. افتعال ميكروبييتس ملاحظه: هنا ، الماصات الدقيقة ذات القطر الداخلي تتراوح بين 6 إلى 12 ميكرومتر وطول تفتق حول 3-4 مم ضرورية. ويرد وصف لطريقه مفصله لتصنيع الماصات المجهرية في ما يلي. ضع الشعرية الزجاجية البورسيليكات في قضيب الساحب وأصلح أحد الطرفين بشد مقبض الباب. ال…

Representative Results

مع البروتوكول المذكور أعلاه ، وقد درسنا مختلفه الاصطناعية العملاقة اونياميلار الحويصلة (GUV) ، التي تم الحصول عليها من فوسفورية: 2-oleoyl-1-بالميتويل–سغليرو-3-فوسفونوكولين (popc) ، بوليمر ثلاثي الكتل: بولي (ايثيلالأكسيد)-ب-بولي (ديميثيلسيلاوكسان)-بي-بولي (ايثي…

Discussion

ان طلاء الماصات المجهرية هو أحد النقاط الرئيسية للحصول علي قياسات موثوقه. يجب منع التصاق الحويصلة بالماصة ، ويشيع استخدام الطلاء في الأدب17،18،19،20،21، مع جيش صرب الجمهورية ، β-الكازين أو surfasil. ونادرا م?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للمخابرات الخاصة بالدعم المالي (ANR Sysa).

Materials

Required equipment and materials for micropipette design
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4 external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.
Filament installed Sutter Instrument Co. FB255B 2.5mm*2.5mm Box Filament
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Microforge NARISHGE Co. MF-900 fitted with two objectives (10x and 32x)
Materials for coating pipette tips with BSA
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) Sigma-Aldrich 10735078001
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
Disposable 10 ml syringe Luer Tip Codan 626616
Disposable 5 ml syringe Luer Tip Codan 62.5607
Disposable acetate cellulose filter Cluzeau Info Labo L5003SPA Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm
Flexible Fused Silica Capillary Tubing Polymicro Technologies. TSP530660 Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm,
Glucose Sigma-Aldrich G5767
Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT Hamilton Syringe Company 1750
Test tube rotatory mixer Labinco 28210109
Micromanipulation Set up
Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series Newport
Damped Optical Table Newport used as support of microscope to prevent external vibrations.
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP 2 The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.
Micrometer Mitutoyo Corporation 350-354-10 Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm
Plexiglass water reservoir (100 ml) Home made
TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). Leica
X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread Newport
Materials for sucrose and amphiphile solution preparation
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Sigma-Aldrich
Chloroform VWR 22711.244
L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) Sigma-Aldrich 810146C Rhodamine tagged lipid
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Electroformation set up
10 µL glass capillary ringcaps Hirschmann 9600110
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
H Grease Apiezon Apiezon H Grease Silicon-free grease
Indium tin oxide coated glass slides Sigma-Aldrich 703184
Needle Terumo AN2138R1 0.8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimeter) Voltcraft VC140
Toluene VWR 28676.297
Voltage generator Keysight 33210A

Referanslar

  1. Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
  2. Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
  3. Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
  4. Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
  5. Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
  6. Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
  7. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
  8. Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
  9. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  10. Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
  11. Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
  12. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  13. Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
  14. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
  15. Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
  16. Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
  17. Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
  18. Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
  19. Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
  20. Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
  21. Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
  22. Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ibarboure, E., Fauquignon, M., Le Meins, J. Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration. J. Vis. Exp. (155), e60199, doi:10.3791/60199 (2020).

View Video