Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo
Özet
Per testare l’effetto di una chemiochina sul reclutamento di macrofagi in vivo, l’intero montaggio in situ ibridazione è stato utilizzato per rilevare l’espressione ectopica della chemiochina, e l’immunostainizzazione è stata utilizzata per etichettare i macrofagi. L’imaging dal vivo è stato utilizzato per l’osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofafi.
Abstract
I pesci zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base e biomedica. Molte linee transgeniche di pesci zebra sono attualmente disponibili per etichettare vari tipi di cellule. A causa del corpo embrionale trasparente del pesce zebra, è conveniente per noi studiare l’effetto di una chemiochina sul comportamento di un certo tipo di cellule in vivo. Qui abbiamo fornito un flusso di lavoro per studiare la funzione di una chemiochina sulla migrazione dei macrofaghi in vivo. Abbiamo costruito un plasmide di sovraespressione per itessuti specifici dei tessuti per sovraesprimere l’IL-34 e abbiamo iniettato il plasmide in embrioni di pesci transgenici con stadio unicellulare i cui macrofagi sono stati specificamente etichettati da una proteina fluorescente. Abbiamo quindi usato l’intero montaggio fluorescente in situ ibridazione e immunostaining per rilevare il modello dell’espressione chemiochina e il numero o la posizione dei macrofagi. Gli embrioni di WT iniettati sono stati sollevati per generare una linea transgenica stabile. Infine, abbiamo usato l’imaging dal vivo confocale per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi nel pesce transgenico stabile per studiare la funzione dell’IL-34 sui macrofagi in vivo.
Introduction
Il pesce zebra è un piccolo pesce dolce tropicale che ha avuto origine in India. Per quanto riguarda la conservazione genica, i pesci zebra hanno una somiglianza dell’87% con l’umano1. Può fornirci informazioni su argomenti correlati dell’uomo studiando la regolazione genica, la funzione delle proteine e il comportamento cellulare come la migrazione, la proliferazione et.al nel pesce zebra. L’embrione di pesce zebra può essere utilizzato per osservare lo sviluppo di embrioni precoci in diverse fasi dopo aver inibito il pigmento. Nel frattempo, ci vogliono solo tre mesi perché il pesce zebra si sviluppi in maturità sessuale, quindi il pesce zebra può produrre centinaia di uova ogni 4 giorni. Mini-dimensioni, allevamento semplice, forte capacità riproduttiva, questi vantaggi rendono la cultura del pesce zebra molto risparmio di spazio, favorevole alla cultura su larga scala. Il topo modello tradizionale di mammiferi ha costi di manutenzione più elevati rispetto al pesce zebra, limitando così la scala di sollevamento del mouse. Nell’aspetto dello sviluppo precoce dell’embrione, l’embrione di topo è difficile da osservare in condizioni vive a causa delle caratteristiche dello sviluppo dell’embrione di topo nel grembo materno. Al contrario, gli embrioni di pesce zebra si sviluppano esternamente e sono trasparenti, quindi sono facili da osservare al microscopio. Inoltre, il pesce zebra è molto facile da costruire una varietà di linee transgeniche per la ricerca sulle funzioni geniche correlate. Attualmente, sono disponibili varie linee transgeniche di pesci zebra per etichettare diversi tipi di cellule. Ora è molto conveniente costruire linee transgeniche per sovraesprimere le chemiochine in luoghi specifici e studiare la funzione delle chemiochine sul comportamento cellulare nel pesce zebra.
Qui, abbiamo fornito un flusso di lavoro per utilizzare la linea transgenica di pesce zebra per studiare la funzione di IL-34 sul comportamento del macrofago in vivo2,3,4,5,6,7. In primo luogo, abbiamo costruito una plasmida di sovraespressione specifica del fegato del gene il34 e iniettato il plasmide in uno stadio unicellulare Tg (mpeg1: GFP) embrioni di pesce che specificamente etichettavano i macrofagi dalla proteina fluorescente GFP. Quindi, abbiamo usato l’intero monte fluorescente in situ ibridazione e immunostaining per rilevare il modello dell’espressione il34 e il numero o la posizione dei macrofagi. Gli embrioni di WT iniettati sono stati sollevati per generare una linea transgenica stabile. In questi passaggi, abbiamo stabilito e convalidato la linea di produzione della citochina e valutato visivamente gli effetti che si possono vedere sulla distribuzione dei macrofafi. Infine, per studiare il comportamento dei macrofagi in risposta alla citochina, abbiamo usato l’imaging dal vivo confocale per osservare direttamente la migrazione dei macrofagi per confermare la funzione di il34 sulla migrazione del macrofago in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto ci permette di indagare la funzione di una chemiochina sul comportamento di macrophagein vivo e la procedura richiede una certa competenza tecnica. In sintesi, ci sono diversi passaggi critici per evitare complicazioni nel protocollo: 1) selezionare una linea transgenica adatta che mostra un segnale transgenico specifico e forte per etichettare la cellula di interesse; 2) selezionare un tessuto appropriato accessibile per l’imaging e la sovraespressione genica transgenica; 3) fare una sonda di…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Jingrong Peng per aver condiviso la linea transgenica Tg (fabp10a: DsRed); Dr. .ilong Wen per la condivisione delle linee transgeniche Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami per aver fornito il vettore pTol2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31771594), dai progetti del Guangdong Science and Technology Plan (2019A030317001) e dai Fondi fondamentali di ricerca per le università centrali (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
Referanslar
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
