Özet

Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo

Published: September 25, 2019
doi:

Özet

Per testare l’effetto di una chemiochina sul reclutamento di macrofagi in vivo, l’intero montaggio in situ ibridazione è stato utilizzato per rilevare l’espressione ectopica della chemiochina, e l’immunostainizzazione è stata utilizzata per etichettare i macrofagi. L’imaging dal vivo è stato utilizzato per l’osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofafi.

Abstract

I pesci zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base e biomedica. Molte linee transgeniche di pesci zebra sono attualmente disponibili per etichettare vari tipi di cellule. A causa del corpo embrionale trasparente del pesce zebra, è conveniente per noi studiare l’effetto di una chemiochina sul comportamento di un certo tipo di cellule in vivo. Qui abbiamo fornito un flusso di lavoro per studiare la funzione di una chemiochina sulla migrazione dei macrofaghi in vivo. Abbiamo costruito un plasmide di sovraespressione per itessuti specifici dei tessuti per sovraesprimere l’IL-34 e abbiamo iniettato il plasmide in embrioni di pesci transgenici con stadio unicellulare i cui macrofagi sono stati specificamente etichettati da una proteina fluorescente. Abbiamo quindi usato l’intero montaggio fluorescente in situ ibridazione e immunostaining per rilevare il modello dell’espressione chemiochina e il numero o la posizione dei macrofagi. Gli embrioni di WT iniettati sono stati sollevati per generare una linea transgenica stabile. Infine, abbiamo usato l’imaging dal vivo confocale per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi nel pesce transgenico stabile per studiare la funzione dell’IL-34 sui macrofagi in vivo.

Introduction

Il pesce zebra è un piccolo pesce dolce tropicale che ha avuto origine in India. Per quanto riguarda la conservazione genica, i pesci zebra hanno una somiglianza dell’87% con l’umano1. Può fornirci informazioni su argomenti correlati dell’uomo studiando la regolazione genica, la funzione delle proteine e il comportamento cellulare come la migrazione, la proliferazione et.al nel pesce zebra. L’embrione di pesce zebra può essere utilizzato per osservare lo sviluppo di embrioni precoci in diverse fasi dopo aver inibito il pigmento. Nel frattempo, ci vogliono solo tre mesi perché il pesce zebra si sviluppi in maturità sessuale, quindi il pesce zebra può produrre centinaia di uova ogni 4 giorni. Mini-dimensioni, allevamento semplice, forte capacità riproduttiva, questi vantaggi rendono la cultura del pesce zebra molto risparmio di spazio, favorevole alla cultura su larga scala. Il topo modello tradizionale di mammiferi ha costi di manutenzione più elevati rispetto al pesce zebra, limitando così la scala di sollevamento del mouse. Nell’aspetto dello sviluppo precoce dell’embrione, l’embrione di topo è difficile da osservare in condizioni vive a causa delle caratteristiche dello sviluppo dell’embrione di topo nel grembo materno. Al contrario, gli embrioni di pesce zebra si sviluppano esternamente e sono trasparenti, quindi sono facili da osservare al microscopio. Inoltre, il pesce zebra è molto facile da costruire una varietà di linee transgeniche per la ricerca sulle funzioni geniche correlate. Attualmente, sono disponibili varie linee transgeniche di pesci zebra per etichettare diversi tipi di cellule. Ora è molto conveniente costruire linee transgeniche per sovraesprimere le chemiochine in luoghi specifici e studiare la funzione delle chemiochine sul comportamento cellulare nel pesce zebra.

Qui, abbiamo fornito un flusso di lavoro per utilizzare la linea transgenica di pesce zebra per studiare la funzione di IL-34 sul comportamento del macrofago in vivo2,3,4,5,6,7. In primo luogo, abbiamo costruito una plasmida di sovraespressione specifica del fegato del gene il34 e iniettato il plasmide in uno stadio unicellulare Tg (mpeg1: GFP) embrioni di pesce che specificamente etichettavano i macrofagi dalla proteina fluorescente GFP. Quindi, abbiamo usato l’intero monte fluorescente in situ ibridazione e immunostaining per rilevare il modello dell’espressione il34 e il numero o la posizione dei macrofagi. Gli embrioni di WT iniettati sono stati sollevati per generare una linea transgenica stabile. In questi passaggi, abbiamo stabilito e convalidato la linea di produzione della citochina e valutato visivamente gli effetti che si possono vedere sulla distribuzione dei macrofafi. Infine, per studiare il comportamento dei macrofagi in risposta alla citochina, abbiamo usato l’imaging dal vivo confocale per osservare direttamente la migrazione dei macrofagi per confermare la funzione di il34 sulla migrazione del macrofago in vivo.

Protocol

NOT:</ Tutti i campioni sono stati trattati con l’acqua uovo fenilthiourea (PTU) per inibire il pigmento. 1. Generazione di Tg (fabp10a:il34) Costrutti transgenici e iniezione di pesce Clonare il promotore di 2,8 kb fabp10a 8 e le aree di codifica IL-34 (ENSDART00000126460.3) del pesce zebra nel vettore pTol2 per generare il costrutto fabp10a-il34. Iniettare i costrutti nello stadio a una cellula Tg (<…

Representative Results

I passaggi coinvolti nel protocollo del pesce zebra sono illustrati nella Figura 2. In primo luogo, è stato generato il costrutto pBLK-fabp10a-il34-sv40 in cui il34 è stato guidato dal promotore fabp10a (Figura 2). Il costrutto è stato microiniettato in embrioni di pesce zebra Tg (mpeg1: GFP) che possono etichettare i macrofagi con embrioni GFP e WT che sono stati innalzati agli adulti per g…

Discussion

Il protocollo qui descritto ci permette di indagare la funzione di una chemiochina sul comportamento di macrophagein vivo e la procedura richiede una certa competenza tecnica. In sintesi, ci sono diversi passaggi critici per evitare complicazioni nel protocollo: 1) selezionare una linea transgenica adatta che mostra un segnale transgenico specifico e forte per etichettare la cellula di interesse; 2) selezionare un tessuto appropriato accessibile per l’imaging e la sovraespressione genica transgenica; 3) fare una sonda di…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Jingrong Peng per aver condiviso la linea transgenica Tg (fabp10a: DsRed); Dr. .ilong Wen per la condivisione delle linee transgeniche Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami per aver fornito il vettore pTol2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31771594), dai progetti del Guangdong Science and Technology Plan (2019A030317001) e dai Fondi fondamentali di ricerca per le università centrali (D2191450).

Materials

Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody Invitrogen A11055
Anti-Digoxigenin-HRP  perkinelmer NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody Abcam ab6658
Reagent
CaCl2H2O Sigma 21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent perkinelmer NEL745001KT
E2 solution 15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetal Bovine Serum(FBS) Life 10099-133
formamide Diamond A100314
glycerol  Sigma V900860
heparin sodium Sigma H3149
hybridization buffer(HB) 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
low melting agarose Sigma A9414
methanol GHTECH 1.17112.023
methylene blue  Sigma M9140
MgSO4 Sigma M2643
Na2HPO4 Sigma S5136
NaCl Sigma S5886
NaHCO3  Sigma S5761
paraformaldehyde(PFA) Sigma 158127 Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
phenylthiourea(PTU) Sigma P7629
1×Plus Amplification Diluent perkinelmer NEL745001KT
Proteinase K  Fermentas E00492
20×Saline sodium citrate(SSC) 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
sodium citrate Sigma A5040
tricaine Sigma E10521
tRNA  Sigma R6625
Tween20 Sigma P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40 For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34 For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP) Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed) Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34) Over-expression IL-34 in liver cells

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Jiang, Y., Chen, J., Xu, J. An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo. J. Vis. Exp. (151), e60161, doi:10.3791/60161 (2019).

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