Generatie chimeric Axolotls met Mutant Haploid Ledematen door embryonale grafting

Historisch gezien is embryonale weefseltransplantatie bij amfibieën een belangrijke techniek geweest voor het verkennen van fundamentele mechanismen van ontwikkelingsbiologie en regeneratie. De axolotl, een soort salamander, beschikt over een indrukwekkend vermogen om weefsels en complexe structuren zoals ledematen en organen na letsel of amputatie te regenereren. Op dezelfde manier indrukwekkend, kunnen ze ontvangen, zonder afwijzing, weefselgrafts van andere individuen in embryonale, jeugdige, en volwassen stadia^1,2,3. Gebieden van embryo’s die hele structuren produceren, zoals ledematen, staarten, ogen en koppen, en meer specifieke weefsels, zoals neuroectoderm en somites, kunnen tussen embryo’s worden geënt om chimerische dieren te produceren^1,2,4,5,6. Al bijna een eeuw hebben studies van dergelijke chimerische dieren cruciale inzichten opgeleverd in regeneratie, weefseldifferentiatie, groottecontrole en patronen^1,7,8.

In het laatste decennium hebben talrijke transcriptiestudies van regenererende weefsels inzichten opgeleverd in de genetische programma’s die ten grondslag liggen aan salamanderregeneratie^{9,10,11,12,13}. Deze studies hebben toegevoegd aan een groeiende lijst van kandidaat-genen die tot op heden grotendeels niet worden gekarakteriseerd in de context van regeneratie. Gerichte mutagenesetechnieken, zoals CRISPR/Cas, maken het nu mogelijk om dergelijke genen te onderzoeken, en dergelijke genetische benaderingen worden sterk vergemakkelijkt door de recente volgorde en assemblage van het grote axolotlgenoom^14,15,16.

We zochten naar technieken die klassieke ontwikkelingsbiologie koppelen aan nieuwe genetische technologie met het oog op het ontleden van de mechanismen van regeneratie. Methoden voor het genereren van haploïde embryo’s van axolotls en andere salamanders zijn vastgesteld voor decennia¹⁷. Hoewel deze technieken al lang worden opgemerkt als voordelen van salamanders als genetisch model organismen¹⁸, weinig latere genetische studies hebben opgenomen haploïde dieren. We gebruiken in vitro activatie in de axolotl om haploïde embryo’s te produceren die dienen als weefseldonoren voor het enten^{van 19}. Met behulp van embryo’s met fluorescerende genetische markers hebben we betrouwbare methoden ontwikkeld voor het genereren van ledematen die bijna volledig afkomstig zijn van donorweefsels(figuur 1A). Door deze twee technieken te combineren, hebben we de late embryonale letaliteit die gepaard gaat met haploidy omzeild, waardoor volledig ontwikkelde, geënte haploïde ledematen(figuur 1B, figuur 1B’tr figuur 2) kunnen worden aangenomen.

Door CRISPR/Cas-gemedieerde mutagenese in haploïde embryo’s uit te voeren voordat we worden geënt om chimerische axolotls met gemuteerde haploïde ledematen te maken, kunnen we de genfunctie specifiek onderzoeken in de context van de ontwikkeling en regeneratie van ledematen. Dit maakt het mogelijk om ledematen te redden van potentieel embryonaal-dodelijke mutanten. Hoewel CRISPR/Cas micro-injectie dieren kan genereren die zeer mutant zijn, zijn dergelijke dieren meestal zeer mozaïek, met een zekere mate van behoud van wildtype allelen en een verscheidenheid aan verschillende mutaties op gerichte locaties^14,20. CRISPR-gebaseerde mutagenese in haploïde cellen verhoogt de penetrance van enkel allele verlies-van-functie mutaties, omdat ze niet kunnen worden gemaskeerd door behouden wildtype allelen. Om deze reden wordt crispr-gebaseerde screening in haploïde cellijnen steeds vaker gebruikt om de genetische basis van veel cellulaire processen te onderzoeken^21,22,23. Door crispr-gebaseerde afstamming tracering te combineren met onze haploïde ledematen knop entandprotocollen, kan de hier beschreven aanpak dienen als een platform voor haploïde genetische schermen bij levende dieren²⁰.