Este protocolo describe experimentos microbianos bajo presiones elevadas para estudiar procesos de biominado in situ. El enfoque experimental emplea un reactor de alta presión mecedora equipado con una célula de reacción de oro y titanio que contiene un cultivo microbiano en un medio ácido y rico en hierro.
Estudios de laboratorio que investigan procesos microbianos subsuperficiales, como la lixiviación de metales en depósitos de mineral profundo (biomining), comparten obstáculos comunes y desafiantes, incluidas las condiciones ambientales especiales que deben replicarse, por ejemplo, alta presión y en algunos casos soluciones ácidas. El primero requiere una configuración experimental adecuada para la presurización de hasta 100 bar, mientras que el segundo exige un contenedor de fluidos con alta resistencia química contra la corrosión y reacciones químicas no deseadas con la pared del contenedor. Para cumplir con estas condiciones para una aplicación en el campo de la biominería in situ, se utilizó una célula de reacción flexible especial de oro y titanio dentro de un reactor de alta presión mecedor utilizado en este estudio. El sistema descrito permitió la simulación de biomining in situ a través de la reducción de hierro microbiano impulsado por azufre en un entorno experimental anóxico, controlado por presión y altamente químicamente inerte. La célula de reacción flexible de oro y titanio puede acomodar hasta 100 ml de solución de muestra, que se puede muestrear en cualquier momento dado, mientras que el sistema mantiene la presión deseada. Los experimentos se pueden realizar en escalas de tiempo que van desde horas hasta meses. El montaje del sistema de reactores de alta presión consume bastante tiempo. Sin embargo, cuando los procesos complejos y desafiantes (microbiológicos) que ocurren en el subsuelo profundo de la tierra en fluidos químicamente agresivos tienen que ser investigados en el laboratorio, las ventajas de este sistema superan las desventajas. Los resultados encontraron que incluso a alta presión el consorcio microbiano está activo, pero a tasas metabólicas significativamente más bajas.
Durante la última década, los esfuerzos para minimizar el impacto de la minería en el medio ambiente han aumentado. La minería a cielo abierto para la extracción de materias primas de minerales (por ejemplo, minerales de sulfuro ricos en cobre), afecta al paisaje circundante por las actividades de excavación y por los grandes volúmenes restantes de rocas de desecho y restos de mineral procesado después de la extracción de metales como el cobre. Extraer cobre directamente del mineral en el subsuelo reduciría significativamente estos impactos. La tecnología de biomining in situ es un candidato prometedor para este proceso1. Esta publicación describe el uso de la actividad microbiana estimulada para extraer los metales preciosos del mineral en una solución acuosa en el subsuelo. Por lo tanto, una solución rica en cobre se puede bombear fácilmente de nuevo a la superficie para concentrar aún más el metal, por ejemplo.
La actividad de los microorganismos acidofílicos de ore-lixiviación se ha estudiado en muchos laboratorios para una amplia gama de parámetros2,3,4,5,6. Sin embargo, los efectos de presión sobre la actividad microbiana resultantes de la diferencia entre las condiciones de laboratorio de superficie ambiente (cerca de 1 bar) y el subsuelo a una profundidad de 1.000 m con condiciones hidrostáticas (100 bar), no están bien documentados. Por lo tanto, los efectos de la presión sobre la reducción de hierro microbiano se han investigado a través de diferentes vías experimentales7. Aquí, la técnica más adecuada se describe en detalle.
Los reactores de alta presión se han utilizado ampliamente para estudiar las reacciones a presiones y temperaturas que ocurren en el subsuelo de la tierra. Estos reactores consisten en un recipiente de reactor en la parte inferior que puede contener una muestra de fluido con un cultivo microbiano. Sentado en la parte superior del recipiente del reactor, el cabezal del reactor ofrece una amplia gama de conexiones e interfaces para medidas de seguridad y sensores de monitoreo (por ejemplo, temperatura o presión). La mayoría de los reactores de alta presión están hechos de acero inoxidable. Este material ofrece alta resiliencia y buenas propiedades de mecanizado, pero la resistencia a la corrosión de la superficie de acero inoxidable no es adecuada para todas las aplicaciones. Por ejemplo, si se investigan soluciones acuosas altamente ácidas o altamente reductoras, pueden producirse reacciones significativas de los compuestos de interés con la pared del reactor. Una manera de evitar esto es insertar un revestimiento en el recipiente del reactor, por ejemplo un revestimiento hecho de vidrio borosilicato7. Es fácil de limpiar y se puede esterilizar mediante autoclave. Además, no es atacado por soluciones acuosas ácidas o reduciendo. A pesar de que un revestimiento puede ayudar a prevenir las reacciones artificiales de la solución o microbios en la solución con la pared del reactor de acero inoxidable, persisten varios problemas. Por un ejemplo, si se forma un gas corrosivo, como el sulfuro de hidrógeno producido por bacterias reductoras de sulfato, este gas podría reaccionar con la superficie descubierta de la cabeza del reactor sentada sobre el revestimiento. Otra desventaja es que no es posible retirar una muestra del reactor manteniendo la presión.
Para superar estas limitaciones, se han desarrollado células de reacción flexibles especializadas dentro de los reactores de alta presión para una variedad de aplicaciones. Una célula8 flexible de politetrafluoroetileno (PTFE) fue diseñada para estudios de solubilidad de sales en salmueras altamente salinas. Sin embargo, la limitación de este sistema es que algunos gases pueden impregnar fácilmente el PTFE. Además, este material todavía tiene una estabilidad de temperatura relativamente baja. Por lo tanto, el sistema se mejoró mediante el diseño de una bolsa de oro flexible con un cabezal de titanio9 para colocar dentro del reactor de alta presión de acero inoxidable. La superficie dorada es resistente a la corrosión contra soluciones y gases ácidos o reductores. La superficie de titanio también es altamente inerte cuando pasa a fondo para formar una capa continua de dióxido de titanio. Durante el muestreo de esta célula de reacción a través de un tubo de muestreo de titanio conectado, la bolsa de oro se encoge en volumen. La presión interna del sistema se mantiene bombeando el mismo volumen de agua, como se retira por muestreo, en el reactor de alta presión de acero inoxidable que acomoda la célula de reacción. La muestra dentro de la célula de reacción se mantiene en movimiento balanceándose o inclinando el reactor de alta presión en más de 90o durante el experimento.
La célula de reacción consta de las partes representadas en la Figura 1:la bolsa de oro, collar de titanio, cabeza de titanio, arandela de acero inoxidable, anillo de perno de compresión de titanio, tubo de muestreo de titanio con glándulas inoxidables y collares para la alta presión coned y conexiones roscadas en ambos lados, y la válvula de titanio. La bolsa de oro es una celda de oro cilíndrico (Au 99.99) con un espesor de pared de 0,2 mm, un diámetro exterior de 48 mm y una longitud de 120 mm.
Todas las piezas de titanio son hechas a medida por el taller a partir de varillas de titanio grado 2. Las dimensiones del collar, la cabeza, la arandela y el anillo del perno de compresión son visibles en la Figura 2. El tubo de muestreo de titanio es un capilar de titanio con un diámetro exterior de 6,25 mm y un espesor de pared de 1,8 mm, lo que resulta en un diámetro interior de 2,65 mm. Se fija en la cabeza de titanio y la válvula de titanio mediante conexiones de alta presión conadas y roscadas que garantizan un sello de superficies de titanio contra titanio. La válvula de titanio de alta presión está equipada con un vástago de apertura lenta para permitir una apertura o muestreo muy controlado incluso a alta presión. Este sistema fue utilizado en numerosos estudios10,11,12.
El método presentado para experimentos de alta presión de reacciones microbianas dentro de soluciones ácidas fue una poderosa herramienta para simular procesos geomicrobiológicos de subsuelo profundo en un entorno de laboratorio.
Hay numerosos pasos de trabajo manual involucrados, algunos de los cuales requieren una atención especial. Como nota general, no se debe utilizar fuerza excesiva al ensamblar las partes individuales de la célula flexible de oro y titanio y el cabezal del reactor (secciones 3 y 4). Si se ignoran las especificaciones del fabricante (por ejemplo, para presión máxima, temperatura, par) , pueden producirse fugas y/o fallos de material.
La limpieza de las piezas de oro y titanio (sección 2.2) es un paso de trabajo indispensable, no sólo para este experimento, sino especialmente para experimentos que implican reacciones (in)orgánicas. Los restos de experimentos anteriores en la célula de oro pueden causar reacciones no deseadas y, por lo tanto, sesgo de resultados. Cuando la célula de oro-titanio montada se instala en el cabezal del reactor, es mejor trabajar de forma rápida y precisa, porque en este momento pequeñas cantidades de oxígeno podrían entrar en la celda de oro. Cerrar la válvula de muestreo antes de salir de la guantera es una buena primera medida para minimizar el intercambio entre la atmósfera ambiente con el interior de la celda de oro.
Una vez que el reactor se coloca en el dispositivo de balanceo, es importante ajustar la velocidad de movimiento de balanceo a 170o/min. Si el reactor de alta presión se mueve demasiado rápido, la ruptura de la célula de oro puede ocurrir debido a efectos gravitacionales o los bordes afilados de las muestras de sedimentos o rocas cuando se utiliza.
Este método se puede utilizar en campos de investigación adicionales. La célula flexible de reacción de oro y titanio tiene el potencial de ser utilizada para un conjunto diverso de investigaciones científicas9 estudiando reacciones a presión y temperatura elevadas y en fluidos o gases altamente corrosivos.
Los microorganismos en el subsuelo profundo a temperaturas superiores a 70 oC en presencia de superficies minerales pueden estimular la producción de hidrógeno molecular o ácidos orgánicos como el acetato incluso bajo presión elevada16. Estos productos, y otros compuestos, podrían inducir una actividad microbiana elevada durante los procesos de biolixiviación in situ, además de los compuestos de azufre investigados en este estudio.
Las aplicaciones incluyen la determinación de la solubilidad de gases e iones en fluidos acuosos, reacciones geoquímicas en condiciones de los sistemas de ventilación hidrotérmica17,la cuantificación del fraccionamiento de isótopos18, reacciones geoquímicas durante el CO 2 secuestros 19,procesos abióticos durante la formación de petróleo y gas en rocas de origen20,y reacciones microbianas a presiones elevadas en el subsuelo21 como en el presente estudio.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) en compartir su experiencia en las células flexibles de reacción de oro y titanio, y a Georg Scheeder (BGR) por su contribución durante la fase inicial de configuración del sistema modificado en Hannover. Nos gustaría dar las gracias a muchos científicos (incluyendo Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gracia-Trampe, Theodor Alpermann) utilizando la configuración en Hannover en numerosos proyectos que contribuyeron en pequeñas mejoras en el camino y Christian Seeger para el desarrollo de la dispositivo de balanceo para los reactores de alta presión. Agradecemos a Laura Castro (Universidad Complutense de Madrid) por las observaciones sede. Y, por último, nos gustaría expresar nuestra gratitud a Nils W’lki por producir este video de alta calidad para el artículo. Este trabajo fue apoyado por el proyecto BIOMOre de la Unión Europea Horizonte 2020 (Acuerdo de subvención n.o 642456).
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |