Este protocolo descreve experimentos microbianos pressões elevadas para estudar processos de biomineração in situ. A aproximação experimental emprega um reator de alta pressão de balanço equipado com uma pilha da reação do ouro-titânio que contem uma cultura microbiana em um meio ácido, ferro-rico.
Estudos laboratoriais que investigam processos microbianos subsuperficiais, como a lixiviação de metais em depósitos de minério profundo (biomineração), compartilham obstáculos comuns e desafiadores, incluindo as condições ambientais especiais que precisam ser replicadas, por exemplo, alta pressão e, em alguns casos, soluções ácidas. O primeiro exige uma instalação experimental apropriada para a pressurização até a barra 100, quando o último exigir um recipiente fluido com resistência química elevada de encontro à corrosão e às reações químicas indesejadas com a parede do recipiente. Para atender a essas condições para uma aplicação no campo da biomineração in situ, uma célula de reação de ouro-titânio flexível especial dentro de um reator de alta pressão de balanço foi usada neste estudo. O sistema descrito permitiu a simulação da biomineração in situ através da redução do ferro microbiano impulsionado por enxofre em um ambiente experimental anóxico, controlado por pressão e altamente quimicamente inerte. A célula de reação de ouro-titânio flexível pode acomodar até 100 mL de solução de amostra, que pode ser amostrada em qualquer ponto de tempo determinado enquanto o sistema mantém a pressão desejada. Experimentos podem ser realizados em escalas temporais variando de horas a meses. A montagem do sistema de reator de alta pressão é bastante demorada. No entanto, quando processos complexos e desafiadores (microbiológicos) que ocorrem na subsuperfície profunda da terra em fluidos quimicamente agressivos têm de ser investigados em laboratório, as vantagens deste sistema superam as desvantagens. Os resultados encontrados que mesmo em alta pressão o consórcio microbiano é ativo, mas a taxas metabólicas significativamente mais baixas.
Durante a última década, os esforços para minimizar o impacto da mineração no meio ambiente aumentaram. A mineração a céu aberto para a extração de matérias-primas de minérios (por exemplo, minérios de sulfeto ricos em cobre), impacta a paisagem circundante pelas atividades de escavação e pelos grandes volumes remanescentes de rochas residuais e restos de minério processado após a extração de preciosos metais como o cobre. Extrair o cobre diretamente do minério na subsuperfície reduziria significativamente estes impactos. A tecnologia da biomineração in situ é um candidato promissor para este processo1. Esta publicação descreve o uso de atividade microbiana estimulada para extrair os metais preciosos do minério em uma solução aquosa na subsuperfície. Assim, uma solução rica em cobre pode ser facilmente bombeada de volta para a superfície para concentrar ainda mais o metal, por exemplo.
A atividade de microrganismos acidofílicos de lixiviação de minério tem sido estudada em muitos laboratórios para uma variedade diversa de parâmetros2,3,4,5,6. No entanto, os efeitos de pressão sobre a atividade microbiana resultante da diferença entre as condições do laboratório de superfície ambiente (perto de 1 bar) e a subsuperfície a uma profundidade de 1.000 m com condições hidroestáticas (~ 100 bar), não são bem documentados. Portanto, os efeitos da pressão sobre a redução do ferro microbiano têm sido investigados por meio de diferentes avenidas experimentais7. Aqui, a técnica mais adequada é descrita detalhadamente.
Reatores de alta pressão têm sido amplamente utilizados para estudar reações em pressões e temperaturas que ocorrem na subsuperfície da terra. Tais reatores consistem em um vaso do reator na parte inferior que pode conter uma amostra fluida com uma cultura microbiana. Sentado em cima do vaso do reator, a cabeça do reator oferece uma variedade diversificada de conexões e interfaces para medidas de segurança e sensores de monitoramento (por exemplo, temperatura ou pressão). A maioria de reatores de alta pressão são feitos do aço inoxidável. Este material oferece alta resiliência e boas propriedades de usinagem, mas a resistência à corrosão da superfície de aço inoxidável não é adequada para cada aplicação. Por exemplo, se forem investigadas soluções aquosas altamente ácidas ou altamente redutoras, podem ocorrer reações significativas dos compostos de interesse com a parede do reator. Uma maneira de evitar isso é inserir um forro no vaso do reator, por exemplo, um forro feito de vidro de borosilicato7. It é fácil de limpar e pode ser esterilizado por autoclaving. Além disso, não é atacada por ácido ou reduzindo soluções aquosas. Mesmo que um forro possa ajudar a impedir reações artificiais da solução ou dos micróbios na solução com a parede do reator do aço inoxidável, diversos problemas permanecem. Para um, se um gás corrosivo é formado, como o sulfeto de hidrogênio produzido por bactérias redutores de sulfato, este gás pode reagir com a superfície descoberta da cabeça do reator sentada acima do forro. Outra desvantagem é que não é possível retirar uma amostra do reator, mantendo a pressão.
Para superar essas limitações, as células de reação flexíveis especializadas dentro dos reatores de alta pressão foram desenvolvidas para uma variedade de aplicações. Uma pilha flexível do politetrafluoretileno (PTFE)8 foi projetada para estudos da solubilidade dos sais em salmouras altamente salinos. No entanto, a limitação deste sistema é que alguns gases podem facilmente permear o PTFE. Além disso, este material ainda tem uma estabilidade de temperatura relativamente baixa. Assim, o sistema foi melhorado projetando um saco flexível do ouro com uma cabeça Titanium9 a ser coloc dentro do reator de alta pressão do inoxidável-aço. A superfície do ouro é resistente à corrosão contra soluções e gases ácidos ou redutores. A superfície do titânio é igualmente altamente inerte quando passivated completamente para dar forma a uma camada contínua do dióxido Titanium. Durante a amostragem desta célula de reação através de um tubo de amostragem de titânio conectado, o saco de ouro encolhe em volume. A pressão interna do sistema é mantida bombeando o mesmo volume de água, como é retirado por amostragem, no reator de alta pressão de aço inoxidável que acomoda a célula de reação. A amostra dentro da célula de reação é mantida em movimento balançando ou inclinando o reator de alta pressão em mais de 90 ° durante o experimento.
A célula de reação consiste nas peças representadas na Figura 1: o saco de ouro, colar de titânio, cabeça de titânio, arruela de aço inoxidável, anel de parafuso de compressão de titânio, tubo de amostragem de titânio com glândulas e colares inoxidáveis para a alta pressão coned e conexões rosqueadas em ambos os lados, e a válvula Titanium. O saco do ouro é uma pilha cilíndrica do ouro (au 99,99) com uma espessura de parede de 0,2 milímetros, um diâmetro exterior de 48 milímetros, e um comprimento de 120 milímetros.
Todas as peças Titanium são feito-à-medida pela oficina das hastes Titanium da classe 2. As dimensões do anel de colarinho, cabeça, arruela e parafuso de compressão são visíveis na Figura 2. O tubo de amostragem de titânio é um capilar de titânio com um diâmetro externo de 6,25 mm e uma espessura de parede de 1,8 mm, resultando em um diâmetro interno de 2,65 mm. Ele é fixado na cabeça de titânio e a válvula de titânio por alta-pressão coned e rosca conexões garantindo um selo de titânio-contra-titânio superfícies. A válvula Titanium de alta pressão é equipada com uma haste de abertura lenta para permitir a abertura ou a amostragem muito controlada mesmo na alta pressão. Este sistema foi utilizado em inúmeros estudos10,11,12.
O método apresentado para experimentos de alta pressão de reações microbianas em soluções ácidas foi uma ferramenta poderosa para simular processos geomicrobiológicos subsuperficiais profundos em um ambiente laboratorial.
Existem inúmeras etapas de trabalho manual envolvidas, algumas das quais exigem atenção especial. Como uma nota geral, nenhuma força excessiva deve ser usada ao montar as partes individuais da pilha ouro-titanium flexível e da cabeça do reator (seções 3 e 4). Se as especificações do fabricante (por exemplo, para a pressão máxima, temperatura, torque) são ignoradas, vazamento e/ou falha de material pode resultar.
A limpeza das peças de ouro e titânio (seção 2,2) é uma etapa de trabalho indispensável, não só para este experimento, mas especialmente para experimentos envolvendo (in-) reações orgânicas. Restos de experimentos anteriores na célula de ouro podem causar reações indesejadas e, portanto, a supressão dos resultados. Quando a célula de ouro-titânio montada é instalada na cabeça do reator, é melhor trabalhar de forma rápida e precisa, porque neste momento pequenas quantidades de oxigênio poderia entrar na célula de ouro. Fechar a válvula de amostragem antes de deixar o Glovebox é uma boa primeira medida para minimizar a troca entre a atmosfera ambiente com o interior da célula dourada.
Uma vez que o reator é coloc no dispositivo de balanço, é importante ajustar a velocidade de movimento de balanço a ~ 170 °/min. Se o reator de alta pressão se move muito rápido, a ruptura da célula de ouro pode acontecer devido a efeitos gravitacionais ou as bordas afiadas de sedimentos ou amostras de rocha quando usado.
Este método pode ser usado em campos de pesquisa adicionais. A célula de reação de ouro-titânio flexível tem o potencial para ser usado para um conjunto diversificado de investigações científicas9 estudando reações em pressão e temperatura elevadas e em fluidos ou gases altamente corrosivos.
Microrganismos na subsuperfície profunda em temperaturas acima de 70 ° c na presença de superfícies minerais podem estimular a produção de hidrogênio molecular ou ácidos orgânicos como o acetato mesmo pressão elevada16. Esses produtos, e outros compostos, podem induzir atividade microbiana elevada durante os processos de biolixiviação in situ, além dos compostos de enxofre investigados neste estudo.
As aplicações incluem a determinação da solubilidade de gases e íons em fluidos aquosos, reações geoquímicas em condições de sistemas de ventilação hidrotermal17, a quantificação do fraccionamento de isótopos18, reações geoquímicas durante co 2 sequestro19, processos abióticos durante a formação de óleo e gás em rochas-fonte20, e reações microbianas em pressões elevadas na subsuperfície21 como no presente estudo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) em compartilhar seus conhecimentos sobre as células de reação de ouro-titânio flexíveis, e Georg Scheeder (BGR) para sua entrada durante a fase inicial de criação do sistema modificado em Hannover. Gostaríamos de agradecer a muitos cientistas (incluindo Katja Heeschen, Andreas risse, Jens Gröger-Trampe, Theodor Alpermann) usando a configuração em Hannover em inúmeros projetos que contribuíram em pequenas melhorias ao longo do caminho e Christian Seeger para o desenvolvimento da dispositivo de balanço para os reatores de alta pressão. Agradecemos a Laura Castro (Universidade Complutense de Madri) por observações de SEM. E, finalmente, gostaríamos de expressar nossa gratidão a Nils Wölki por produzir este vídeo de alta qualidade para o artigo. Este trabalho foi apoiado pelo projeto Horizonte 2020 da União Europeia BIOMOre (acordo de subvenção # 642456).
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |