유연한 금-티타늄 반응 세포를 사용하여 지하 생물 광의 맥락에서 압력 의존미생물 활성 시뮬레이션

1. 미생물 배양 배지 및 접종준비 출판된 기술13에따라 자가영양성 핵생물에 대한 기저염 배지를 준비한다. 증류수(mg/L)에 아래 화학물질을 용해및 혼합: Na2SO 4·10H2O(150) (NH4)2SO4 (450), KCl (50), MgSO4·7H2O (500),KH2PO4 (50), 및 Ca(NO) 3) 2·4H2O(7). 1,000x 농축 미량 요소 용액 (g/L) 포함 1 mL/L 추가: ZnSO4·7H2O(10), CuSO4·5H2O(1), MnSO4· H2O (0.76), CoSO4·7H2O(1), CrK (SO4)2·12H2O(0.4), H3BO3 (0.6), 나무4·2H2O(0.5), 니소4·6H2O(1), 나 2개 SeO4 (0.51), Na2WO4·2H 2O(0.1), 나보3(0.1). 5M 황산을 첨가하여 pH를 1.8로 조절합니다. 121°C및 1.2bar에서 오토클레이브에서 배지를 20분 동안 살균하고 0.22 μm 의 기공 크기 주사기 필터를 통해 여과하여 철분 용액을 살균합니다. 멸균된 기저 염 배지의 50 mL를 혈청 병에 옮기고 철분 용액과 원소 황을 각각 50 mM및 10 g/L의 최종 농도에 첨가합니다. 배지를 여러 개의 메소산성 철산화원생생물(14)으로구성된 혼합 배양물로 접종한다. 세럼 병을 멸균된 부틸 고무 스토퍼로 캡하고 알루미늄 크림프로 밀봉합니다. 25 분 동안 용존 산소를 제거하기 위해N2로 배양 배지를 활발하게 거품을 낸다. 두 개의 바늘을 사용하고, 병 머리에 한 개를 더 깊게 놓고, 다른 하나는 캡에 가깝게 놓는다. CO2를 주입하여 혈청 병의 헤드스페이스에서 90%N2 및 10%CO2 분위기를 얻었다. 어둠 속에서 30°C에서 교반하지 않고 배양을 배양한다. 2. 금 티타늄 반응 전지 및 고압 반응기의 제조 금 티타늄 반응 세포를 청소합니다. 반응 셀을 개별 부품으로 분해하여 스테인리스 스틸 부품과 산의 접촉을 피하거나 열에 다른 열 팽창 특성을 가진 조립된 부품의 노출을 방지합니다. 실험 중에 시료와 접촉할 표면(예: 골드 백, 티타늄 헤드, 티타늄 샘플링 튜브 및 티타늄 밸브)을 청소합니다. 골드 백과 티타늄 헤드를 유리 비커에 넣습니다. 모든 부품을 커버하기에 충분한 10% HCl을 추가합니다. 가열 플레이트에 산을 50 °C로 가열하면서 3 시간 동안 저어줍니다. PTFE 핀셋으로 부품을 산용액에서 제거하고 탈이온수로 헹굽습니다. 골드 백과 티타늄 헤드의 내부 표면을 65% HNO3로 철저히 헹구고 탈이온수로 헹구십시오. 티타늄 샘플링 튜브와 티타늄 밸브의 내부 표면을 10% HCl로 헹구고 탈이온수, 65% HNO3,그리고 다시 탈이온수를 헹구십시오. 아세톤으로 헹각하여 유기 오염으로부터 모든 부품을 청소하십시오. 오븐의 모든 부품을 105°C에서 1시간 이상 건조시십시오. 금백, 티타늄 헤드 및 티타늄 샘플링 튜브의 표면을 공기 분위기에서 머플 로에서 4시간 동안 450°C의 온도에 노출시킴으로써 가열합니다.참고: 이 절차는 표면을 살균하고 모든 티타늄 표면에 이산화 티타늄 층을 형성합니다. 티타늄 부품은 열처리 후 노란색에서 파란색으로 변해야 합니다. 안닐은 프로판 토치로 열을 가하여 작은 결정화 도메인을 재설정함으로써 금의 유연성을 증가시다. 실험에서 금 백 부피의 마지막 수축 중에 형성되었을 수 있는 금의 꼬임을 줄이기 위해 금 표면을 온전히 가열합니다. 금이 녹지 않도록 한 곳에서 너무 많이 가열하지 않도록 하십시오.참고: 금 표면의 빨간색 광선은 충분한 가열을 보여줍니다. 티타늄 칼라에 골드 백을 조립하고, 티타늄 샘플링 튜브를 땀샘에 대해 10 Nm의 토크를 사용하여 티타늄 헤드에 튜브를 샘플링합니다. 고압 반응기를 검사합니다. 반응기의 손상, 부식 및 느슨한 부품이 있는지 시각적으로 확인합니다.참고: 밀봉이 이루어지는 씰과 커프에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 흑연 개스킷이 이전에 반응기를 밀봉하는 데 사용된 경우, 그 잔해는 여전히 커프에 있을 수 있으며 다음 실험 전에 플라스틱 핀으로 제거해야 합니다. 고압 반응기 헤드의 추력 볼트에 구리 황화물 페이스트를 적용합니다. 그리스가 전체 스레드에 분산되어 있는지 확인합니다. 스크류 피팅 압축 씰에서 남은 흑연 포장 길이를 확인합니다. 3. 결산 조건하에서 금 티타늄 반응 세포를 채우고 조립 글러브 박스를 로드합니다. 섹션 1에 따라 세럼 병에 배양 배지를 준비한다. 나중에 알루미늄 호일의 샘플과 접촉할 금티타늄 반응 셀의 부품을 감싸서 잠재적인 오염을 최소화합니다. 글러브 박스의 대기실을 열고 잠금을 해제하고 모든 인바운드 재료를 이동 식 트레이에 적재하고 앞면 덮개를 닫고 잠급니다. 대기실을 3배 대피시키고 고순도 질소로 범람시. 장갑을 착용하고 내부 커버에 가능한 한 가깝게 하십시오. 내부 커버를 열고 이동식 트레이에서 인바운드 재질을 제거합니다. 내부 덮개를 닫고 잠급전합니다. 골드 셀을 채웁니다. 깨끗한 골드 백을 풀고 유리 비커로 일어서십시오. 세균 배양 및 원소 황 100 mL를 포함하는 혈청 병을 엽니다. 세럼 병을 부드럽게 흔들어 세균 문화를 골드 백으로 옮김을 옮김. 반응 셀을 조립합니다. 티타늄 헤드를 부착된 티타늄 샘플링 튜브로 골드 백의 상부 테두리를 둘러싸는 티타늄 칼라에 삽입합니다.참고: 티타늄 헤드의 원추형 하부의 밀봉 표면이 90°앞뒤로 돌려 부드럽게 맞도록 하십시오. 와셔와 압축 볼트 링을 티타늄 샘플링 튜브 위에 밀어 티타늄 헤드 위로 밀어 냅니다.참고: 티타늄 칼라의 압축 볼트 링을 30°로 돌려 티타늄 칼라의 플랜지와 스러스트 볼트 링을 정렬합니다. 6개의 알렌 나사를 동일한 정도로 고정하여 티타늄 칼라의 금백의 가장 위쪽 림에 티타늄 헤드의 균일한 압력 분포를 보장한다(즉, 반응 셀의 밀봉 표면).참고: 반대 쪽 나사의 토크가 먼저 증가되도록 압축 볼트 링에 Allen 나사를 손으로 고정한 후 시계 방향으로 계속합니다. 티타늄 튜브 상단에 샘플링 밸브를 다시 설치합니다. 연결을 손으로 단단히 조이고 밸브를 닫아야합니다. 글러브 박스에서 모든 부품을 제거합니다. 4. 반응 셀로 고압 반응기 조립 반응 셀을 반응기 헤드에 조립합니다.참고 : 고압 반응기의 설치는 샘플링 밸브가 반응기 헤드의 나사 씰을 통해 튜브를 안내하기 위해 제거되어야하기 때문에 샘플링 튜브의 개방 된 끝을 주변 대기에 매우 짧은 노출과 함께 제공됩니다. 설치를 위해, 반응기 헤드는 이미 벤치 바이스에 배치되어야한다. 45° 각도로 취급이 용이합니다. 샘플링 튜브를 제자리에 배치하는 압축 씰 피팅(반응기 헤드게이지 블록 어셈블리의 중앙 위치에 위치)을 열어야 합니다. 샘플링 튜브 상단의 티타늄 샘플링 밸브, 나사 및 칼라를 제거합니다. 반응기 헤드의 중앙 구멍을 통해 부착된 반응 셀로 튜브를 약 5cm 통과할 때까지 튜브를 안내합니다. 큰 나사를 튜브 위로 밀어 작은 옷깃을 고정합니다.참고: 이제 반응 셀 어셈블리가 반응기 헤드를 통해 다시 미끄러지며 양손은 샘플링 밸브를 자유롭게 다시 설치할 수 있습니다. 티타늄 밸브를 다시 부착하십시오. 압축 씰 피팅을 조입니다. 벤치 바이스에서 반응기 헤드를 제거하여 반응기 용기에 설치합니다. 반응기를 밀봉 할 준비. 반응기 용기의 커프에 흑연 밀봉을 넣습니다. 반응기 헤드를 부착된 반응 셀과 함께 반응기 용기에 조심스럽게 놓습니다.참고: 열전대를 포함한 반응기 헤드는 금백이나 열전대를 손상시키지 않도록 반응기 용기에 신중하게 배치해야 합니다. 탈이온화 및 수돗물(약 1:1 비율)으로 반응기 용기를 채웁니다. 반응기를 밀봉합니다. 칼라를 확인하여 압축 볼트의 아래쪽 끝이 스레드에서 튀어나오지 않는지 확인합니다. 그렇지 않으면 압력 용기가 올바르게 설치되지 않습니다. 칼라를 들어 올리고 반응기 헤드혈관 인터페이스의 돌출 된 가장자리 주위에 놓습니다. 옷깃을 부드럽게 움직이면 적절한 핏이 됩니다. 칼라를 제자리에 고정한 스냅 잠금 장치를 닫습니다. 십자 패턴에 따라 압축 볼트를 고정하고 제조업체가 권장하는 최종 값이 달성될 때까지 적당한 단계로 토크를 늘립니다.참고: 다른 고압 반응기 시스템은 다른 토크 값을 가질 수 있습니다. 마지막으로, 압축 볼트를 시계 방향으로 고정합니다. 흔들기 장치에 고압 반응기를 설치합니다.참고: 흔들기 장치에 고압 반응기의 설치는 독일 하노버의 연방 지질 과학 및 천연 자원 연구소에서 제조 된 맞춤형 모델에 대해 설명됩니다. 따라서, 설명된 설치는 유사한 설계의 장치에 대한 일반적인 지침이다. 반응기를 흔들 장치에 조심스럽게 장착합니다.참고 : 게이지 블록 조립 부품 (예 : 기동계 또는 샘플링 튜브 나사)에 의해 고압 반응기를 고정하면서 흔들 장치로 낮추는 것이 가장 좋습니다. 긴 나사 한 쌍위에 두 개의 클램프로 반응기를 고정시. 각 나사에 와셔를 놓고 나사 너트로 클램프를 조입니다. 열전대, 압력 변환기 및 발열체의 제어 장치를 연결합니다.참고: 모든 전선이 흔들기 모션에 충분한 길이를 유지하고 가열된 표면에 접촉하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 반응기 용기 위에 발열체를 밀어 내고 나사 잠금 장치를 조입니다.참고: 시스템을 가압하는 물은 고압 펌프가 있는 저수지에서 채취됩니다. 그것은 고압 반응기로 스테인레스 스틸 모세 혈관을 통해 전송됩니다.참고 : 고압 반응기의 흔들림은 반응 세포 내용물 (즉, 가스, 유체 및 그 안에있는 모든 고체 상)의 철저한 혼합을 보장합니다. 느린 흔들림 속도는 고체를 빠르게 이동하거나 고온에서 유연한 금에 중력 영향으로 인한 변형으로 인해 금 백의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 흔들 시스템은 180 °에 가깝게 회전 할 수 있습니다. 5. 실험 시작 모니터링 소프트웨어의 온도 및 압력 한계가 원하는 값으로 설정되어 있는지 확인합니다.참고: 본 실험에서 그들은 70°C 및 25 MPa로 설정하였다. 누출 검사를 수행합니다. 스테인리스 스틸 모세관인 압력 파이프를 반응기 헤드에 연결합니다. 누출을 지속적으로 확인하면서 뚜렷한 간격으로 목표 압력에 대한 압력을 높입니다. 펌프의 유량이 거의 0이 될 때까지 압력을 일정하게 유지합니다.참고: 물에 압축되고 용존된 공기가 미묘한 흐름 판독값에서 장시간 볼 수 있다는 점에 유의하십시오. 누출 확인을 성공적으로 마친 후 가열을 시작합니다. 가압 펌프의 로깅을 시작합니다. 가열에 대한 설정점을 원하는 값으로 조정하고 소프트웨어로 가열을 시작합니다. 정기적으로 모든 매개 변수와 시스템 상태를 확인합니다. 목표 온도에 도달한 후 압력 파이프를 조이십시오. 흔들 장치를 시작합니다. 6. 작동 모드에서 고압 반응기 샘플링 샘플을 채취하려면 고압 반응기 상단의 샘플링 밸브의 Luer Lock 커넥터에 5mL 주사기를 부착합니다. 조심스럽게 밸브를 열고 유체 샘플이 고압 반응기 내부의 압력에 의해 주사기로 밀어 넣습니다. 샘플링된 부피가 1mL에 도달하면 밸브를 닫습니다. 주사기를 분리합니다. 주사기의 샘플을 즉시 2 mL 튜브로 처리하기 위해 연기 후드에 넣습니다. 7 . 유체 샘플 분석 참고 : 덜 일반적인 광측정 페로진 분석 (즉, 섹션 7.1)에 대한 단계만 자세히 설명되며 다른 단계는 미생물학의 표준 작동 절차이기 때문에 비디오에서 언급됩니다. 페로진 검법을 사용하여 용존 철(Fe2+(aq))과총 철(Fetot)의농도를 광도측정하여 결정한다15. 알려진 양의 FeSO4·7H2O를물에 용해시켜 일련의 철본용액을 준비한다. 이 표준 레벨의 50 μL을 1 M 페로진 용액의 1 mL과 혼합합니다.참고 : 용해 된 철과 페로진의 반응은 보라색 복합체를 형성합니다. 색상의 강도는 철철 농도와 상관관계가 있습니다. 철 분 농도와 철 페로진 복합체의 흡광도 사이에 교정 곡선을 설정합니다. 확립된 표준 곡선에 따라 두 개의 병렬 측정에서 샘플의 철 농도를 계산합니다. 반도체 pH 전극과 은 염화물 전극이 있는 디지털 pH/레독스 미터로 pH 값과 산화/환원 전위(ORP)를 각각 분석합니다. Thoma 챔버가있는 가벼운 현미경을 사용하여 플랑크토닉 세포를 직접 계산하십시오. 전자 현미경 검사법 (SEM)을 스캔하여 세포 형태를 조사합니다. 0.1-0.2 μm 기공 크기 필터를 통해 다양한 조건하에서 성장한 플랑크토닉 세포를 필터합니다. 아세톤으로 시료를 탈수하고 90% 아세톤에서 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 임계 점 건조에 의해 샘플을 건조하고 흑연 또는 금으로 코팅. 10 kV에서 필드 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM)를 가진 견본을 검토하십시오.