フレキシブル金チタン反応細胞を用いて、地下バイオマイニングのコンテキストにおける圧力依存微生物活性をシミュレート

1. 微生物培養の培地および接種の調製 公表された技術13に従って自己栄養原核生物のための基底塩培地を調記する。蒸留水で以下の化学物質を溶解して混合する(mg/L):Na2SO 4×10H2O(150)(NH4)2SO4(450)、KCl(50)、MgSO 4・7H2O(500)、KH2PO4(50)、Ca(NO)3)2・4H2O(7)。 1,000x濃縮微量微量素液を含む1mL/L(g/L):ZnSO4・7H2O(10)、CuSO4・5H2O(1)、MnSO4・H2O (0.76), CoSO4・7H2O (1), CrK(SO4)2・12H2O (0.4), H3BO3 (0.6), ナモオ4・2H2O (0.5), ニソ4・6H2O (1), ナ2SeO4 (0.51)、Na2WO4·2H2O (0.1)、および NaVO3 (0.1)。5M硫酸を加えてpHを1.8に調整します。 121 °Cと1.2バーで121°Cと1.2バーで培地を殺菌し、0.22 μmの細孔サイズのシリンジフィルターを通して濾過して鉄製の鉄溶液を殺菌します。 殺菌された基底塩培地の50mLを血清ボトルに移し、それぞれ50mMと10g/Lの最終濃度に鉄溶液と元素硫黄を加加える。 いくつかのメソ酸性鉄酸化原核生物14からなる混合培養物で培地を接種する。 滅菌ブチルゴムストッパーで血清ボトルをキャップし、アルミ圧着でシールします。 N2で培養培地を激しく泡立て、溶存酸素を25分間取り除きます。 CO2を注入し、血清ボトルのヘッドスペースに90%N2および10%のCO2雰囲気を得る。暗闇で30°Cで撹拌することなく培養する。 2. 金チタン反応セルと高圧反応器の調製 金チタン反応セルをきれいにします。 反応セルを個々の部品に分解して、ステンレス鋼部品との酸の接触や、熱に対する異なる熱膨張特性を持つ組み立てられた部品の露出を避けます。 実験中にサンプルと接触する表面(金袋、チタンヘッド、チタンサンプリングチューブ、チタンバルブ)をきれいにします。 ガラスビーカーに金袋とチタンヘッドを入れます。 すべての部品をカバーするのに十分な10%HClを追加します。 加熱プレート上の酸を50°Cに3時間加熱しながら撹拌する。 酸溶液からPTFEピンセットで部品を取り出し、脱イオン水ですすいでください。 金袋とチタンヘッドの内面を65%HNO3で十分に洗い流し、その後脱イオン水で洗い流します。 チタンサンプリングチューブとチタンバルブの内面を10%HClですすいで、続いて脱イオン水、65%HNO3、再び脱イオン水を使用します。 アセトンで洗い洗うことで、有機汚染からすべての部分をきれいにします。 オーブン内のすべての部品を105°Cで少なくとも1時間乾燥させます。 大気中のマッフル炉で450°Cの温度に露出して、金袋、チタンヘッド、チタンサンプリングチューブの表面を加熱します。注:この手順は、表面を殺菌し、すべてのチタン表面にパッシベート二酸化チタン層の形成をもたらします。チタン部品は、熱処理後に黄色から青色にする必要があります。 金細胞をアニールして、プロパントーチで熱を加えることで小さな結晶化ドメインをリセットすることで金の柔軟性を高めます。実験でゴールドバッグの体積が最後に縮小する際に形成された金のキンクを減らすために、金面を周りに加熱します。溶融を避けるために、一箇所で金を加熱しすぎないようにしてください。注:金面の赤い輝きは十分な加熱を示しています。 チタンカラーに金袋を組み立て、チタンサンプリングチューブをチタンヘッドに10Nmのトルクで取り付けます。 高圧原子炉を点検する。 原子炉の損傷、腐食、緩んだ部品を目視で確認してください。注:シールとシールが行われるカーフに特別な注意を払う必要があります。以前に黒鉛ガスケットを使用して原子炉をシールした場合、その残骸はまだカーフ内にあり、次の実験の前にプラスチックピンで除去する必要があります。 高圧反応器ヘッドのスラストボルトに硫化銅ペーストを塗布します。グリースが糸全体に分散されていることを確認します。 残りの黒鉛パッキングの長さについては、スクリューフィッティング圧縮シールを確認してください。 3. 無気力条件下での金チタン反応細胞の充填と組み立て グローブボックスをロードします。 セクション1に従って血清ボトルに培養培地を調剤する。 後でサンプルと接触する金チタン反応セルの部品をアルミホイルで包み、潜在的な汚染を最小限に抑えます。 グローブボックスのアンテカーバーを開けてロック解除し、すべてのインバウンド材料を可動トレイにロードし、前面カバーを閉じてロックします。 アンテカーバー3xを避難させ、高純度窒素であふれさせる。 手袋を着用し、内側のカバーにできるだけ近づけます。内側カバーのロックを解除して開き、可動トレイからインバウンドマテリアルを取り外します。 内側のカバーを閉じてロックします。 ゴールドセルを埋めます。 清潔なゴールドバッグを包み、ガラスビーカーで立ちます。100mLの細菌培養物と元素硫黄を含む血清ボトルを開きます。 血清ボトルをそっと振り、細菌培養をゴールドバッグに移します。 反応セルを組み立てます。 付属のチタンサンプリングチューブを付けたチタンヘッドを、ゴールドバッグの上縁を囲むチタンカラーに挿入します。注:チタンヘッドの円錐下部のシール面が90°前後に回して滑らかにフィットすることを確認してください。 ワッシャーと圧縮ボルトリングをチタンサンプリングチューブの上にチタンヘッドにスライドさせます。注:チタンカラーの圧縮ボルトリングを30°回転させ、チタンカラーとスラストボルトリングのフランジを揃えます。 6本のアレンネジを同じ程度に固定して、チタンカラーの金袋の最上部の縁にチタンヘッドの均等な圧力分布を確保します(すなわち、反応セルのシール面)。注: 圧縮ボルト リングのアレン ネジを手で締めて、時計回りに続行する前に、反対側のネジのトルクが最初に増加 (十字架) にします。 チタンチューブ上部のサンプリングバルブを再取り付けします。接続を手で締め、バルブを閉じてください。 グローブ ボックスからすべてのパーツを取り外します。 4. 高圧反応器を反応セルで組み立てる 反応セルを原子炉ヘッドに組み立てます。注:高圧リアクターの設置は、サンプリングチューブの開いた端を周囲の大気に非常に短い露出で行います。インストールのために、原子炉ヘッドは既にベンチバイスに配置する必要があります。45°の角度は容易な処理を可能にする。サンプリングチューブを所定の位置に保持する圧縮シールフィッティング(原子炉ヘッドのゲージブロックアセンブリの中央位置に位置する)は、開く必要があります。 チタンサンプリングバルブ、ネジ、およびサンプリングチューブの上の襟を取り外します。 反応セルを反応セルを原子炉ヘッドの中央穴に通して約5cmのチューブが通るまで導く。大きなネジをチューブの上にスライドさせ、小さな襟を固定します。注:反応セルアセンブリは原子炉ヘッドを通って戻ってスライドすることができず、両手でサンプリングバルブを自由に取り付け直すことができます。 チタンバルブを取り付け直します。 圧縮シールフィッティングを締めます。 原子炉ヘッドをベンチバイスから取り外し、原子炉容器に取り付けます。 原子炉を封鎖する準備をしろ 原子炉容器のカーフに黒鉛シールを貼る。 原子炉ヘッドは、付着した反応セルを原子炉容器の上に慎重に置きます。注:熱電対を含む原子炉ヘッドは、金袋や熱電対を損傷しないように、原子炉容器に慎重に配置する必要があります。 原子炉容器を脱イオン水と水道水の混合物で充填します(約1:1の比率で)。 原子炉を封鎖する 首輪をチェックして、圧縮ボルトの下端が糸から突き出ていないことを確認します。それ以外の場合、圧力容器は正しく取り付けられていない。 首輪を持ち上げ、原子炉ヘッド容器インターフェースの突出エッジの周りに置きます。首輪をそっと動かすと、適切なフィット感が得られます。首輪を所定の位置に保持しているスナップロックを閉じます。 十字パターンに従って圧縮ボルトを固定し、メーカーが推奨する最終値が達成されるまで適度なステップでトルクを増やします。注:異なる高圧リアクターシステムは、異なるトルク値を持つことができます。 最後に、圧縮ボルトを時計回りに固定します。 高圧反応器をロッキング装置に取り付けます。注:ロッキングデバイスへの高圧原子炉の設置は、ドイツのハノーバーにある連邦地球科学天然資源研究所で製造されたカスタムメイドのモデルについて説明されています。したがって、説明されているインストールは、同等の設計のデバイスの一般的なガイドラインです。 原子炉をロッキング装置に慎重に取り付けます。注:高圧反応器をゲージブロックアセンブリ部品(例えば、マノメーターやサンプリングチューブネジ)で保持し、ロッキングデバイスに下げるのが最善です。 長いネジの上に2つのクランプで原子炉を固定します。 各ネジにワッシャーを置き、クランプをネジナットで締めます。 熱電対、圧力トランスデューサ、および加熱素子の制御ユニットを接続します。注:すべてのワイヤが揺れ動きに十分な長さであることを確認し、加熱された表面への接触を防ぐことが重要です。 加熱素子を原子炉容器の上にスライドさせ、スクリューロックを締めます。注:システムを加圧する水は、高圧ポンプで貯水池から取られます。それは高圧反応器にステンレス鋼の毛細血管を通して移される。注:高圧反応器の揺れは、反応細胞の内容物(ガス、流体、およびその中のすべての固相)の完全な混合を保証します。低速のロッキング速度は、速く動く固体による金袋への損傷を防ぐために、または高温でのフレキシブルゴールドへの重力効果による変形を防ぐために重要です。ロッキングシステムは180°近くで回転することができます。 5. 実験開始 監視ソフトウェアの温度と圧力の制限が目的の値に設定されているかどうかを確認します。注:この実験では、70°Cおよび25MPaに設定した。 リーク チェックを実行します。 圧力管、ステンレス鋼の毛細血管を原子炉ヘッドに接続します。 漏れを継続的にチェックしながら、明確な間隔で目標圧力に圧力を上げます。 ポンプの流量がほぼゼロになるまで圧力定量を保持します。注:水中の圧縮性、溶解した空気は、微妙な流れの読み取り値で長い間見えるように注意してください。 リークチェックが成功した後、加熱を開始します。 加圧ポンプのロギングを開始します。 加熱の設定点を所望の値に調整し、ソフトウェアで加熱を開始します。 すべてのパラメーターとシステム状況を定期的にチェックします。 目標温度に達した後、圧力管を締め付けないでください。 ロッキング デバイスを起動します。 6. 高圧原子炉を作動モードでサンプリングする サンプルを採取するには、高圧反応器上部のサンプリングバルブのLuer Lockコネクタに5mLシリンジを取り付けます。 慎重にバルブを開き、高圧反応器内の圧力によって流体サンプルをシリンジに押し込みます。サンプリングされた体積が1 mLに達した後、バルブを閉じます。注射器を取り外します。 処理のためにヒュームフードの2 mLチューブにすぐに注射器のサンプルを移します。 7 .流体サンプルの分析 注:他のステップは微生物学の標準的な操作手順であるため、あまり一般的でないフォトメトリックフェロジンアッセイ(すなわち、セクション7.1)のステップのみがここに詳細に説明され、ビデオに記載されています。 フェロジンアッセイを使用して、溶解鉄鉄(Fe2+(aq))および総鉄(Fetot)15の濃度を光量測定的に決定する。 FeSO 4・7H2 Oの既知の量を水中に溶解することにより、一連の鉄標準溶液を調製する。 これらの標準レベルの50 μLを1Mフェロジン溶液の1 mLと混合します。注:溶存鉄鉄とのフェロジンの反応は、紫色の複合体を形成します。色の強度は鉄の濃度に相関する。 鉄鉄濃度と鉄フェロジン複合体の吸光度との間のキャリブレーション曲線を確立する。 確立された標準曲線に従って、2つの平行測定からサンプルの鉄鉄の濃度を計算します。 pH値と酸化還元電位(ORP)をデジタルpH/レドックスメーターでセミマイクロpH電極、塩化銀電極でそれぞれ解析します。 トーマ室を用いた光顕微鏡を用いて、プランクトン細胞を直接数える。 電子顕微鏡(SEM)をスキャンして細胞形態を調べます。 0.1−0.2 μmの細孔サイズフィルターを介して異なる条件下で増殖したプランクトン細胞をフィルターします。 アセトンでサンプルを脱水し、90%のアセトンで4°Cで一晩保存します。 クリティカルポイント乾燥でサンプルを乾燥させ、グラファイトまたはゴールドでコーティングします。 10kVのフィールド発光走査型電子顕微鏡(FE-SEM)で試料を調べる。