Dieses Protokoll beschreibt mikrobielle Experimente unter erhöhten Drücken, um Biomining-Prozesse vor Ort zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz verwendet einen schaukelnden Hochdruckreaktor, der mit einer Gold-Titan-Reaktionszelle ausgestattet ist, die eine mikrobielle Kultur in einem sauren, eisenreichen Medium enthält.
Laborstudien zur Untersuchung von mikrobiellen Prozessen unter der Oberfläche, wie z. B. Metallauslaugung in tiefen Erzvorkommen (Biomining), haben gemeinsame und herausfordernde Hindernisse, einschließlich der besonderen Umweltbedingungen, die repliziert werden müssen, z. B. Hochdruck und in einigen Fällen saure Lösungen. Ersteres erfordert einen Versuchsaufbau, der für die Druckaufschlagung bis 100 bar geeignet ist, während letztere einen Flüssigkeitsbehälter mit hoher chemischer Beständigkeit gegen Korrosion und unerwünschte chemische Reaktionen mit der Behälterwand erfordert. Um diese Bedingungen für eine Anwendung im Bereich des In-situ-Biobergbaus zu erfüllen, wurde in dieser Studie eine spezielle flexible Gold-Titan-Reaktionszelle in einem Schaukelhochdruckreaktor verwendet. Das beschriebene System ermöglichte die Simulation von In-situ-Biomining durch schwefelgetriebene mikrobielle Eisenreduktion in einer anoxischen, druckgesteuerten, hochchemisch inerten Versuchsumgebung. Die flexible Gold-Titan-Reaktionszelle kann bis zu 100 ml Probenlösung aufnehmen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgetastet werden kann, während das System den gewünschten Druck beibehält. Experimente können auf Zeitskalen von Stunden bis Monaten durchgeführt werden. Die Montage des Hochdruckreaktorsystems ist ziemlich zeitaufwändig. Wenn jedoch komplexe und herausfordernde (mikrobiologische) Prozesse, die im tiefen Erduntergrund in chemisch aggressiven Flüssigkeiten auftreten, im Labor untersucht werden müssen, überwiegen die Vorteile dieses Systems die Nachteile. Die Ergebnisse ergaben, dass das mikrobielle Konsortium auch bei hohem Druck aktiv ist, aber mit deutlich niedrigeren Stoffwechselraten.
In den letzten zehn Jahren haben die Bemühungen, die Auswirkungen des Bergbaus auf die Umwelt zu minimieren, zugenommen. Der Tagebau für die Rohstoffgewinnung von Erzen (z.B. kupferreiche Sulfiderze) wirkt sich durch die Grabungsarbeiten und die großen Restmengen von Abfallgesteinen und Resten von verarbeitetem Erz nach der Gewinnung von wertvollen Metalle wie Kupfer. Die direkte Gewinnung von Kupfer aus dem Erz im Untergrund würde diese Auswirkungen erheblich reduzieren. Die Technologie des In-situ-Biobergbaus ist ein vielversprechender Kandidat für diesen Prozess1. Diese Publikation beschreibt die Verwendung von stimulierter mikrobieller Aktivität, um die Edelmetalle aus dem Erz in eine wässrige Lösung im Untergrund zu extrahieren. So kann eine kupferreiche Lösung leicht wieder an die Oberfläche gepumpt werden, um beispielsweise das Metall weiter zu konzentrieren.
Die Aktivität erzauslaugungssauer saurophiler Mikroorganismen wurde in vielen Laboratorien für eine Vielzahl von Parametern2,3,4,5,6untersucht. Druckeffekte auf die mikrobielle Aktivität, die sich aus dem Unterschied zwischen den Umgebungsoberflächenbedingungen (nahe 1 bar) und dem Untergrund in einer Tiefe von 1.000 m bei hydrostatischen Bedingungen (ca. 100 bar) ergeben, sind jedoch nicht gut dokumentiert. Daher wurden die Auswirkungen des Drucks auf die mikrobielle Eisenreduktion durch verschiedene experimentelle Wege untersucht7. Hier wird die am besten geeignete Technik ausführlich beschrieben.
Hochdruckreaktoren wurden ausgiebig eingesetzt, um Reaktionen bei Drücken und Temperaturen im Erduntergrund zu untersuchen. Solche Reaktoren bestehen aus einem Reaktorbehälter am Boden, der eine Flüssigkeitsprobe mit einer mikrobiellen Kultur enthalten kann. Der Reaktorkopf, der auf dem Reaktorbehälter sitzt, bietet eine Vielzahl von Anschlüssen und Schnittstellen für Sicherheitsmaßnahmen und Überwachungssensoren (z. B. Temperatur oder Druck). Die meisten Hochdruckreaktoren sind aus Edelstahl gefertigt. Dieses Material bietet eine hohe Belastbarkeit und gute Bearbeitungseigenschaften, aber die Korrosionsbeständigkeit der Edelstahloberfläche ist nicht für jede Anwendung ausreichend. Wenn beispielsweise hochsäuernde oder stark reduzierende wässrige Lösungen untersucht werden, können signifikante Reaktionen der von Interesse sindden Verbindungen mit der Reaktorwand auftreten. Eine Möglichkeit, dies zu vermeiden, besteht darin, einen Liner in den Reaktorbehälter einzufügen, z. B. einen Liner aus Borosilikatglas7. Es ist leicht zu reinigen und kann durch Autoklavieren sterilisiert werden. Darüber hinaus wird es nicht von sauren oder reduzierenden wässrigen Lösungen angegriffen. Auch wenn ein Liner helfen kann, künstliche Reaktionen der Lösung oder Mikroben in der Lösung mit der Edelstahl-Reaktorwand zu verhindern, bleiben mehrere Probleme bestehen. Zum einen, wenn ein ätzendes Gas gebildet wird, wie Schwefelwasserstoff, das von sulfatreduzierenden Bakterien produziert wird, könnte dieses Gas mit der unbedeckten Oberfläche des Reaktorkopfes über dem Liner reagieren. Ein weiterer Nachteil ist, dass es nicht möglich ist, eine Probe aus dem Reaktor zu ziehen, während der Druck aufrecht erhalten bleibt.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden spezielle flexible Reaktionszellen in den Hochdruckreaktoren für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt. Eine flexible Polytetrafluorethylenzelle (PTFE)wurde für Löslichkeitsstudien von Salzen in hochsalzsalzierten Salzen entwickelt. Die Einschränkung dieses Systems ist jedoch, dass einige Gase das PTFE leicht durchdringen können. Darüber hinaus weist dieses Material noch eine relativ niedrige Temperaturstabilität auf. So wurde das System durch die Entwicklung eines flexiblen Goldbeutels mit einem Titankopf9 im Edelstahl-Hochdruckreaktor verbessert. Die Goldoberfläche ist korrosionsbeständig gegen saure oder reduzierende Lösungen und Gase. Die Titanoberfläche ist auch sehr inert, wenn sie gründlich zu einer kontinuierlichen Titandioxidschicht passiviert wird. Bei der Probenahme aus dieser Reaktionszelle durch ein angeschlossenes Titan-Probenahmerohr schrumpft der Goldbeutel im Volumen. Der Innendruck des Systems wird aufrechterhalten, indem die gleiche Wassermenge, wie sie durch Probenahme entnommen wird, in den Hochdruckreaktor aus Edelstahl pumpt, der die Reaktionszelle aufnehmen kann. Die Probe in der Reaktionszelle wird durch Schaukeln oder Kippen des Hochdruckreaktors während des Experiments um mehr als 90° in Bewegung gehalten.
Die Reaktionszelle besteht aus den in Abbildung 1dargestellten Teilen: Goldbeutel, Titankragen, Titankopf, Edelstahlscheibe, Titan-Kompressionsbolzenring, Titan-Probenahmerohr mit Rostdrüsen und Kragen für den Hochdruck-Kegel und Gewindeanschlüsse auf beiden Seiten und das Titanventil. Der Goldbeutel ist eine zylindrische Goldzelle (Au 99.99) mit einer Wandstärke von 0,2 mm, einem Außendurchmesser von 48 mm und einer Länge von 120 mm.
Alle Titanteile werden von der Werkstatt aus Titanstäben der Sorte 2 maßgeschneidert. Die Abmessungen des Kragens, des Kopfes, der Scheibe und des Kompressionsbolzenrings sind in Abbildung 2sichtbar. Das Titan-Probenahmerohr ist eine Kapillare aus Titan mit einem Außendurchmesser von 6,25 mm und einer Wandstärke von 1,8 mm, was zu einem Innendurchmesser von 2,65 mm führt. Es wird in den Titankopf und das Titanventil durch Hochdruck-Kegel- und Gewindeverbindungen fixiert, die eine Abdichtung von Titan-gegen-Titan-Oberflächen gewährleisten. Das Hochdruck-Titanventil ist mit einem langsam öffnenden Stiel ausgestattet, um auch bei hohem Druck eine sehr kontrollierte Öffnung oder Probenahme zu ermöglichen. Dieses System wurde in zahlreichen Studien10,11,12verwendet.
Die vorgestellte Methode für Hochdruckexperimente von mikrobiellen Reaktionen in sauren Lösungen war ein leistungsfähiges Werkzeug, um tiefe geomikrobiobiologische Prozesse unter der Oberfläche in einer Laborumgebung zu simulieren.
Es sind zahlreiche manuelle Arbeitsschritte erforderlich, von denen einige besondere Aufmerksamkeit erfordern. Generell darf bei der Montage der einzelnen Teile der flexiblen Gold-Titan-Zelle und des Reaktorkopfes (Abschnitte 3 und 4) keine übermäßige Kraft verwendet werden. Werden die Spezifikationen des Herstellers (z. B. für maximalen Druck, Temperatur, Drehmoment) ignoriert, kann es zu Leckagen und/oder Materialausfällen kommen.
Die Reinigung der Gold- und Titanteile (Abschnitt 2.2) ist ein unverzichtbarer Arbeitsschritt, nicht nur für dieses Experiment, sondern vor allem für Experimente mit (in-)organischen Reaktionen. Reste aus früheren Experimenten in der Goldzelle können unerwünschte Reaktionen und damit eine Verzerrung der Ergebnisse verursachen. Wenn die montierte Gold-Titan-Zelle im Reaktorkopf installiert ist, ist es am besten, schnell und präzise zu arbeiten, da zu diesem Zeitpunkt kleine Mengen Sauerstoff in die Goldzelle gelangen könnten. Das Schließen des Probenahmeventils vor dem Verlassen der Handschuhbox ist eine gute erste Maßnahme, um den Austausch zwischen der Umgebungsatmosphäre mit dem Inneren der Goldzelle zu minimieren.
Sobald der Reaktor in der Schaukelvorrichtung platziert ist, ist es wichtig, die Schaukelbewegungsgeschwindigkeit auf 170°/min einzustellen. Bewegt sich der Hochdruckreaktor zu schnell, kann es aufgrund von Gravitationseffekten oder den scharfen Kanten von Sediment- oder Gesteinsproben bei Verwendung zu einem Bruch der Goldzelle kommen.
Diese Methode kann in weiteren Forschungsbereichen eingesetzt werden. Die flexible Gold-Titan-Reaktionszelle hat das Potenzial, für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Untersuchungen eingesetzt zu werden9, die Reaktionen bei erhöhtem Druck und Temperatur und in stark korrosiven Flüssigkeiten oder Gasen untersuchen.
Mikroorganismen im tiefen Untergrund bei Temperaturen über 70 °C in Gegenwart mineralischer Oberflächen können die Produktion von molekularem Wasserstoff oder organischen Säuren wie Acetat auch unter erhöhtem Druck stimulieren16. Diese Produkte und andere Verbindungen könnten zusätzlich zu den in dieser Studie untersuchten Schwefelverbindungen eine erhöhte mikrobielle Aktivität während der In-situ-Bioleaching-Prozesse induzieren.
Anwendungen umfassen die Bestimmung der Löslichkeit von Gasen und Ionen in wässrigen Flüssigkeiten, geochemische Reaktionen unter Bedingungen hydrothermaler Entlüftungssysteme17, die Quantifizierung der Isotopenfraktionierung18, geochemische Reaktionen während CO 2 Sequestrierung19, abiotische Prozesse bei der Bildung von Öl und Gas in Quellengesteinen20, und mikrobielle Reaktionen bei erhöhten Drücken im Untergrund21 wie in der vorliegenden Studie.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) für den Austausch seiner Expertise zu den flexiblen Gold-Titan-Reaktionszellen und Georg Scheeder (BGR) für seinen Einsatz in der Anfangsphase des Aufbaus des modifizierten Systems in Hannover. Wir danken vielen Wissenschaftlern (darunter Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gröger-Trampe, Theodor Alpermann) die das Setup in Hannover in zahlreichen Projekten nutzten, die auf dem Weg zu kleinen Verbesserungen beitrugen, und Christian Seeger für die Entwicklung der Schaukelvorrichtung für die Hochdruckreaktoren. Wir danken Laura Castro (Complutense University of Madrid) für die SEM-Beobachtungen. Und abschließend möchten wir Nils Wölki unseren Dank für die Produktion dieses hochwertigen Videos für den Artikel aussprechen. Diese Arbeit wurde durch das Projekt BIOMOre der Europäischen Union (Grant-Vereinbarung Nr. 642456) unterstützt.
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |