Ce protocole décrit les expériences microbiennes sous des pressions élevées pour étudier les processus de biomines in situ. L’approche expérimentale utilise un réacteur à haute pression à bascule équipé d’une cellule de réaction or-titanium contenant une culture microbienne dans un milieu acide et riche en fer.
Les études de laboratoire sur les processus microbiens souterrains, comme le lessivage des métaux dans les gisements de minerai profond (biomines), partagent des obstacles communs et difficiles, y compris les conditions environnementales particulières qui doivent être reproduites, par exemple, la haute pression et, dans certains cas, des solutions acides. Le premier nécessite une configuration expérimentale adaptée à la pressurisation jusqu’à 100 barres, tandis que le second exige un récipient fluide avec une forte résistance chimique contre la corrosion et les réactions chimiques indésirables avec la paroi du conteneur. Pour répondre à ces conditions pour une application dans le domaine de la biomines in situ, une cellule de réaction spéciale flexible or-titanium à l’intérieur d’un réacteur à haute pression à bascule a été utilisée dans cette étude. Le système décrit a permis la simulation de la biomining in situ par la réduction microbienne de fer sulfureuse dans un environnement expérimental anoxique, sous pression et hautement chimiquement inerte. La cellule de réaction flexible or-titanium peut accueillir jusqu’à 100 ml de solution d’échantillon, qui peut être échantillonnée à n’importe quel moment donné tandis que le système maintient la pression désirée. Les expériences peuvent être effectuées sur des échelles de temps allant de heures à plusieurs mois. L’assemblage du système de réacteur à haute pression prend assez de temps. Néanmoins, lorsque des processus complexes et difficiles (microbiologiques) se produisant dans le sous-sol profond de la terre dans des fluides chimiquement agressifs doivent être étudiés en laboratoire, les avantages de ce système l’emportent sur les inconvénients. Les résultats ont révélé que même à haute pression, le consortium microbien est actif, mais à des taux métaboliques significativement inférieurs.
Au cours de la dernière décennie, les efforts visant à minimiser l’impact de l’exploitation minière sur l’environnement se sont intensifiés. L’exploitation à ciel ouvert pour l’extraction des matières premières des minerais (p. ex., les minerais de sulfure riches en cuivre) a un impact sur le paysage environnant par les activités d’excavation et par les grands volumes restants de roches résiduelles et de restes de minerai transformé après l’extraction de précieux métaux comme le cuivre. L’extraction du cuivre directement du minerai dans le sous-sol réduirait considérablement ces impacts. La technologie de la biomines in situ est un candidat prometteur pour ce processus1. Cette publication décrit l’utilisation de l’activité microbienne stimulée pour extraire les métaux précieux du minerai dans une solution aqueuse dans le sous-sol. Ainsi, une solution riche en cuivre peut être facilement pompée à la surface pour concentrer davantage le métal, par exemple.
L’activité des micro-organismes acidophiliques de minerai-lixiviation a été étudiée dans beaucoup de laboratoires pour un éventail divers de paramètres2,3,4,5,6. Cependant, les effets de pression sur l’activité microbienne résultant de la différence entre les conditions ambiantes de laboratoire de surface (près de 1 barre) et le sous-sol à une profondeur de 1 000 m avec des conditions hydrostatiques (100 barres) ne sont pas bien documentés. Par conséquent, les effets de la pression sur la réduction microbienne du fer ont été étudiés à travers différentes avenues expérimentales7. Ici, la technique la plus appropriée est décrite en détail.
Les réacteurs à haute pression ont été largement utilisés pour étudier les réactions aux pressions et aux températures qui se produisent dans le sous-sol de la terre. Ces réacteurs sont constitués d’une cuve de réacteur au fond qui peut contenir un échantillon de liquide avec une culture microbienne. Assis au-dessus de la cuve du réacteur, la tête du réacteur offre un large éventail de connexions et d’interfaces pour les mesures de sécurité et les capteurs de surveillance (p. ex., température ou pression). La plupart des réacteurs à haute pression sont en acier inoxydable. Ce matériau offre une grande résilience et de bonnes propriétés d’usinage, mais la résistance à la corrosion de la surface en acier inoxydable n’est pas suffisante pour chaque application. Par exemple, si des solutions aqueuses très acides ou fortement réducteurs sont étudiées, des réactions significatives des composés d’intérêt avec la paroi du réacteur peuvent se produire. Une façon d’éviter cela est d’insérer une doublure dans la cuve du réacteur, par exemple une doublure en verre borosilicate7. Il est facile à nettoyer et peut être stérilisé par autoclaclacage. En outre, il n’est pas attaqué par des solutions acides ou aqueuses. Même si une doublure peut aider à prévenir les réactions artificielles de la solution ou des microbes dans la solution avec la paroi du réacteur en acier inoxydable, plusieurs problèmes subsistent. D’une part, si un gaz corrosif se forme, comme le sulfure d’hydrogène produit par des bactéries qui réduisent le sulfate, ce gaz pourrait réagir avec la surface découverte de la tête du réacteur située au-dessus de la doublure. Un autre inconvénient est qu’il n’est pas possible de retirer un échantillon du réacteur tout en maintenant la pression.
Pour surmonter ces limites, des cellules de réaction flexibles spécialisées à l’intérieur des réacteurs à haute pression ont été développées pour une variété d’applications. Unecellule 8 flexible de polytétrafluoroethylene (PTFE) a été conçue pour des études de solubilité des sels dans les saumures fortement salines. Cependant, la limitation de ce système est que certains gaz peuvent facilement imprégner le PTFE. En outre, ce matériau a encore une stabilité de température relativement faible. Ainsi, le système a été amélioré en concevant un sac en or flexible avec une tête de titane9 à placer à l’intérieur du réacteur à haute pression en acier inoxydable. La surface dorée est résistante à la corrosion contre les solutions acides ou réducteurs. La surface de titane est également très inerte lorsqu’elle est passivated à fond pour former une couche continue de dioxyde de titane. Lors de l’échantillonnage de cette cellule de réaction à travers un tube d’échantillonnage de titane connecté, le sac d’or rétrécit en volume. La pression interne du système est maintenue en pompant le même volume d’eau, comme le retire l’échantillonnage, dans le réacteur à haute pression en acier inoxydable qui peut accueillir la cellule de réaction. L’échantillon à l’intérieur de la cellule de réaction est maintenu en mouvement en faisant basculer ou incliner le réacteur à haute pression de plus de 90 degrés au cours de l’expérience.
La cellule de réaction se compose des pièces représentées dans la figure 1: le sac en or, le collier en titane, la tête en titane, la rondelle en acier inoxydable, l’anneau de boulon de compression de titane, le tube d’échantillonnage de titane avec glandes et colliers inoxydables pour le coned à haute pression et connexions filetées des deux côtés, et la valve en titane. Le sac en or est une cellule en or cylindrique (Au 99,99) d’une épaisseur de mur de 0,2 mm, d’un diamètre extérieur de 48 mm et d’une longueur de 120 mm.
Toutes les pièces en titane sont fabriquées sur mesure par l’atelier à partir de tiges de titane de grade 2. Les dimensions du collier, de la tête, de la rondelle et de l’anneau de boulon de compression sont visibles dans la figure 2. Le tube d’échantillonnage en titane est un capillaire de titane d’un diamètre extérieur de 6,25 mm et d’une épaisseur de 1,8 mm, ce qui donne un diamètre intérieur de 2,65 mm. Il est fixé dans la tête de titane et la valve de titane par des connexions à coned et filetées à haute pression assurant un sceau de titane contre les surfaces de titane. La soupape de titane à haute pression est équipée d’une tige d’ouverture lente pour permettre une ouverture ou un échantillonnage très contrôlé, même à haute pression. Ce système a été utilisé dans de nombreuses études10,11,12.
La méthode présentée pour les expériences à haute pression des réactions microbiennes dans les solutions acides était un outil puissant pour simuler les processus géomicrobiologiques souterrains profonds dans un environnement de laboratoire.
Il y a de nombreuses étapes de travail manuelles impliquées, dont certaines nécessitent une attention particulière. En général, aucune force excessive ne doit être utilisée lors de l’assemblage des différentes parties de la cellule flexible or-titanium et de la tête du réacteur (sections 3 et 4). Si les spécifications du fabricant (p. ex., pour la pression maximale, la température, le couple) sont ignorées, des fuites et/ou une défaillance matérielle peuvent en résulter.
Le nettoyage des pièces d’or et de titane (section 2.2) est une étape de travail indispensable, non seulement pour cette expérience, mais surtout pour les expériences impliquant des réactions organiques (in-). Les restes d’expériences antérieures dans la cellule d’or peuvent provoquer des réactions indésirables et donc biaiser les résultats. Lorsque la cellule d’or-titanium assemblée est installée dans la tête du réacteur, il est préférable de travailler rapidement et précisément, car à ce moment-là de petites quantités d’oxygène pourraient entrer dans la cellule d’or. Fermer la soupape d’échantillonnage avant de quitter la boîte à gants est une bonne première mesure pour minimiser l’échange entre l’atmosphère ambiante et l’intérieur de la cellule dorée.
Une fois que le réacteur est placé dans le dispositif de bascule, il est important de placer la vitesse de mouvement de bascule à 170 ‘/min. Si le réacteur à haute pression se déplace trop vite, la rupture de la cellule d’or peut se produire en raison d’effets gravitationnels ou des bords tranchants des sédiments ou des échantillons de roche lorsqu’il est utilisé.
Cette méthode peut être utilisée dans d’autres domaines de recherche. La cellule de réaction flexible or-titanium a le potentiel d’être utilisée pour un ensemble diversifié d’études scientifiques9 étudiant des réactions à haute pression et température et dans des fluides ou des gaz fortement corrosifs.
Les micro-organismes dans le sous-sol profond à des températures supérieures à 70 oC en présence de surfaces minérales peuvent stimuler la production d’hydrogène moléculaire ou d’acides organiques comme l’acétate, même sous une pression élevée16. Ces produits, et d’autres composés, pourraient induire une activité microbienne élevée au cours des processus de biolixiviation in situ, en plus des composés sulfureux étudiés dans cette étude.
Les applications comprennent la détermination de la solubilité des gaz et des ions dans les fluides aqueux, les réactions géochimiques aux conditions des systèmes d’évent hydrothermaux17, la quantification de la fractionnement des isotopes18, les réactions géochimiques pendant le CO 2 séquestration19, processus abiotiques lors de la formation du pétrole et du gaz dans les roches sources20, et réactions microbiennes à des pressions élevées dans le sous-sol21 comme dans la présente étude.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) en partageant son expertise sur les cellules flexibles de réaction or-titanium, et Georg Scheeder (BGR) pour son apport au cours de la phase initiale de la mise en place du système modifié à Hanovre. Nous tenons à remercier de nombreux scientifiques (dont Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Groger-Trampe, Theodor Alpermann) qui ont utilisé la configuration à Hanovre dans de nombreux projets qui ont contribué à de petites améliorations en cours de route et Christian Seeger pour le développement de la pour les réacteurs à haute pression. Nous remercions Laura Castro (Université Complutense de Madrid) pour les observations SEM. Enfin, nous tenons à exprimer notre gratitude à Nils Wilki pour la production de cette vidéo de haute qualité pour l’article. Ces travaux ont été soutenus par le projet BIOMOre de l’Union européenne Horizon 2020 (accord de subvention no 642456).
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |