使用柔性金钛反应细胞在地下生物采矿环境中模拟压力依赖微生物活性

1. 微生物培养的培养和接种的准备 根据已公布的技术13，为自营养原核生物制备基底盐培养基。溶解和混合蒸馏水中以下的化学品 （mg/L）： Na2SO4+10H2O （150） （NH4）2SO4 （450）， KCl （50）， MgSO4+7H2O （500）， KH2PO4 （50） 和 Ca （NO3）2±4H2O （7）。 添加包含（g/L）的 1，000x 浓缩微量元素溶液的 1 mL/L：ZnSO4+7H2O （10）、CuSO4+5H2O （1）、MnSO4|H2O （0.76），CoSO4+7H2O （1）， CrK （SO4）2+12H2O （0.4）， H3BO3 （0.6）， 纳莫4+2H2O （0.5）， 尼索4+6H2O （1）， 纳2SeO4 （0.51），Na2WO4+2H2O （0.1） 和 NaVO3 （0.1）。加入5M硫酸，将pH态调节至1.8。 在 121°C 和 1.2 bar 的高压灭菌器中对介质进行消毒 20 分钟，并通过 0.22 μm 孔径注射器过滤器进行过滤，对铁铁溶液进行消毒。 将50 mL的消毒基底盐培养基转移到血清瓶中，并将铁铁溶液和元素硫分别加入50 mM和10 g/L的最终浓度。 接种介质与混合培养由几个嗜酸性铁氧化原核生物14组成。 用消毒的丁基橡胶塞盖住血清瓶，用铝压接密封。 用N2大力泡培养基，剥离溶解氧25分钟。使用两针，将一针深放在瓶头，另一针接近瓶盖。 注射CO2，在血清瓶的头部空间获得90%的N2和10%的CO2大气。在黑暗中，在不搅拌30°C的情况下孵育培养。 2. 金钛反应电池和高压反应器的制备 清洁金钛反应细胞。 将反应单元分解到各个部件中，以避免酸与不锈钢部件接触，或将具有不同热膨胀特性的组装部件暴露至热中。 清洁实验期间与样品接触的表面（即金袋、钛头、钛取样管和钛阀）。 将金袋和钛头放入玻璃烧杯中。 添加足够的 10% HCl 以覆盖所有部件。 将加热板上的酸加热至 50°C 3 小时，同时搅拌。 从酸溶液中取出带有 PTFE 钳子的部件，然后用去离子水冲洗。 用 65% HNO3彻底冲洗金袋和钛头的内表面，然后用去离子水冲洗。 用10%HCl冲洗钛取样管和钛阀的内表面，然后用去离子水，65%HNO3，然后再次去离子水。 用丙酮洗净所有零件，使其免受有机污染。 在 105°C 下干燥烤箱中的所有部件至少 1 小时。 将金袋、钛头和钛取样管的表面暴露在 450°C 的温度下加热 4 小时，在空气环境中的消声炉中加热。注：此程序对表面进行消毒，导致在所有钛表面形成钝化二氧化钛层。热处理后，钛部件应呈黄色至蓝色。 通过用丙烷割炬加热来重置小结晶域，使金细胞受到破坏，从而增加黄金的灵活性。加热黄金表面，以减少在实验中最后一次收缩金袋体积时可能形成的金质结。确保不要在一个地方加热黄金太多，以避免其熔化。注：金表面的红色发光显示足够的加热。 使用 10 Nm 的扭矩将金袋组装到钛领中，将钛取样管放入钛头。 检查高压反应器。 目视检查反应器的可能损坏、腐蚀和松动部件。注意：应特别注意密封的密封件和进行密封的路缘。如果以前使用石墨垫片来密封反应器，则其残余物可能仍在路缘中，应在下一次实验前用塑料销将其拆下。 在高压反应器头的推力螺栓上涂上硫化铜膏。确保润滑脂分布在整个螺纹上。 检查螺钉安装压缩密封的长度，以寻找剩余的石墨包装长度。 3. 在缺氧条件下填充和组装金钛反应细胞 装入手套箱。 根据第1节，在血清瓶中制备培养基。 包裹金钛反应细胞的部件，这些部件稍后将与铝箔中的样品接触，以尽量减少任何潜在的污染。 打开并解锁手套箱的前室，将所有入站材料装载到可移动托盘上，然后关闭并锁定前盖。 疏散前室3x，并淹没它与高纯度氮。 戴上一副手套，尽可能靠近内盖。解锁并打开内盖，从可移动托盘中取出入站材料。 关闭并锁定内盖。 填充金单元格。 例如，打开干净的金袋，用玻璃烧杯站立起来。打开含有100 mL细菌培养物和元素硫的血清瓶。 轻轻摇动血清瓶，将细菌培养物转移到金袋中。 组装反应细胞。 将钛头与随附的钛取样管插入连接金袋上部边缘的钛领中。注：确保钛头的圆锥下部密封表面平稳地适合，前后转动90°。 将垫圈和压缩螺栓环滑到钛取样管上。注：将钛环中的压缩螺栓环转动 30°，以对齐钛领和推力螺栓环的法兰。 将六个 Allen 螺钉固定到相同的程度，以确保钛头在钛领（即反应单元的密封表面）金袋最上部边缘上均匀分配压力。注：将压缩螺栓环中的 Allen 螺钉固定，直到手紧，以便先增加相反螺钉的扭矩（交叉），然后再顺时针继续。 重新安装钛管顶部的取样阀。用手固定连接并确保关闭阀门。 从手套箱中取出所有零件。 4. 将高压反应器与反应单元组装在一起 将反应单元组装到反应器头。注：高压反应器的安装使取样管的开端与周围大气接触的时间很短，因为必须拆下取样阀以引导该管穿过反应器头的螺钉密封。对于安装，应将反应器头放入工作台。45° 角度允许更容易处理。压缩密封接头（位于反应器头的量盖块组件的中心位置），将取样管固定到位，需要打开。 拆下取样管顶部的钛取样阀、螺钉和衣领。 引导管，将反应细胞附着在反应器头的中央孔中，直到约5厘米的管穿过。将大螺钉滑到管子上并固定小衣领。注：现在反应单元组件不能滑回反应器头，双手可以自由重新安装取样阀。 重新连接钛气门。 拧紧压缩密封接头。 将反应堆头从工作台上拆下，将其安装在反应堆容器上。 准备密封反应器。 将石墨密封在反应堆容器的轮缘上。 小心地将带有附加反应单元的反应堆头放在反应器容器上。注：反应器头（包括热电偶）必须小心地放置在反应器容器上，不得损坏金袋或热电偶。 向反应器容器中填充去离子和自来水的混合物（大约以 1：1 的比例）。 密封反应器。 检查衣领，确保压缩螺栓的下端没有伸出螺纹。否则，压力容器将不能正确安装。 提起衣领并将其放在反应器头容器界面的突出边缘周围。轻轻移动衣领，将产生适当的配合。合上卡扣锁，将衣领固定到位。 按照纵横交错的图案固定压缩螺栓，以中等步骤增加扭矩，直到达到制造商建议的最终值。注：不同的高压反应器系统可能具有不同的扭矩值。 最后，以顺时针方式固定压缩螺栓。 在摇动装置中安装高压反应器。注：德国汉诺威联邦地球科学和自然资源研究所生产的定制模型描述了在摇动装置中安装高压反应器。因此，描述的安装是同类设计的设备的一般准则。 小心地将反应堆安装在摇动装置中。注：最好用量具组件部件（例如，电力计或取样管螺钉）握住高压反应器，同时将其放入摇动装置中。 用两个夹子固定在一对长螺钉上。 将夹板放在每个螺钉上，用螺钉螺母拧紧夹具。 连接热电偶、压力传感器和加热元件的控制单元。注：请务必确保所有导线长度足以进行摇动运动，并防止接触加热表面。 将加热元件滑过反应器容器并拧紧其螺钉锁。注：向系统加压的水取自带高压泵的储液罐。它通过不锈钢毛细管输送到高压反应器中。注：高压反应器的摇动保证了反应细胞含量（即气体、流体及其所有固体相）的彻底混合。缓慢的摇动速度对于防止快速移动的固体或因重力作用在高温下对柔性金体而变形而损坏金袋非常重要。摇动系统可旋转近 180°。 5. 开始实验 检查监控软件中的温度和压力限制是否设置为所需值。注：在本实验中，它们被设置为 70°C 和 25 MPa。 执行泄漏检查。 将压力管（不锈钢毛细管）连接到反应器头。 以不同的间隔将压力升高到目标压力，同时持续检查泄漏情况。 保持压力常数，直到泵的流量接近于零。注意：请注意，在水中的可压缩溶解空气在细微的流动读数中长时间可见。 成功进行泄漏检查后，启动加热。 启动加压泵的测井。 将加热的设定点调整到所需的值，然后使用软件开始加热。 定期检查所有参数和系统状态。 达到目标温度后，拧紧压力管。 启动摇动设备。 6. 在运行模式下对高压反应堆进行取样 要取样，请将 5 mL 注射器连接到高压反应器顶部取样阀的 Luer Lock 连接器上。 小心地打开阀门，让液体样品通过高压反应器内的压力推入注射器。采样体积达到 1 mL 后关闭阀门。分离注射器。 立即将注射器中的样品转移到烟机罩中的 2 mL 管中进行处理。 7 .流体样品分析 注： 此处仅详细介绍了不太常见的光度法铁氧测法测定步骤（即第 7.1 节），并在视频中提到，因为其他步骤是微生物学中的标准操作程序。 使用铁氧体测定法对溶解铁（Fe2+（aq）和总铁 （Fetot）15的浓度进行光度测定。 通过在水中溶解已知数量的 FeSO4+7 H2O，制备一系列铁质标准溶液。 将 50 μL 的标准电平与 1 m 铁津溶液的 1 mL 混合。注：铁氧体与溶解铁的反应形成紫色复合物。颜色的强度与铁铁浓度相关。 在铁铁浓度和铁铁-铁氧合物的吸收率之间建立校准曲线。 根据既定的标准曲线，通过两个平行测量值计算样品铁铁的浓度。 分别使用带半微pH电极的数字pH/氧化/还原计和氯化银电极分析pH值和氧化/还原电位（ORP）。 使用带Thoma腔室的光学显微镜直接对浮游细胞进行计数。 通过扫描电子显微镜（SEM）研究细胞形态。 通过 0.1±0.2 μm 孔径过滤器过滤在不同条件下生长的木板细胞。 用丙酮脱水样品，在4°C的90%丙酮中储存过夜。 通过临界点干燥样品，并涂有石墨或金。 在 10 kV 下使用场发射扫描电子显微镜 （FE-SEM） 检查试样。