استخدام خلايا تفاعل الذهب والتيتانيوم المرنة لمحاكاة النشاط الميكروبي المعتمد علي الضغط في سياق الحيوية تحت السطحية
Özet
يصف هذا البروتوكول التجارب الميكروبية تحت ضغوط مرتفعه للدراسة في عمليات البيولوجيا الموضعية. ويستخدم النهج التجريبي مفاعلا هزازا عالي الضغط مزودا بخليه تفاعل من الذهب والتيتانيوم تحتوي علي ثقافة جرثوميه في وسط حمضي غني بالحديد.
Abstract
وتتقاسم الدراسات المختبرية التي تحقق في العمليات الميكروبية تحت السطحية ، مثل النض المعدني في رواسب الخامات العميقة (الإحيائي) ، عقبات مشتركه وصعبه ، بما في ذلك الظروف البيئية الخاصة التي يلزم تكرارها ، مثل الضغط العالي وفي بعض الحالات الحلول الحمضية. الاولي يتطلب الاعداد التجريبية مناسبه للضغط تصل إلى 100 بار ، في حين ان هذا الأخير يتطلب حاويه السوائل مع مقاومه كيميائية عاليه ضد التاكل والتفاعلات الكيميائية غير المرغوب فيها مع جدار الحاوية. لتلبيه هذه الشروط لتطبيق في مجال الحيوية في الموقع ، استخدمت في هذه الدراسة خليه مرنه خاصه للرد علي الذهب والتيتانيوم داخل مفاعل هزاز عالي الضغط. وقد سمح النظام الموصوف بمحاكاة البيولوجيا الاحيائيه في الموقع من خلال الحد من الحديد الميكروبي الذي يحركه الكبريت في بيئة تجريبية غير سامه وخاضعه للضغط وخاملة كيميائيا للغاية. يمكن ان تستوعب خليه رد الفعل المرنة من الذهب والتيتانيوم ما يصل إلى 100 مل من محلول العينة ، والتي يمكن أخذ عينات في اي نقطه زمنيه معينه بينما يحافظ النظام علي الضغط المطلوب. ويمكن اجراء التجارب علي الجداول الزمنيه التي تتراوح بين ساعات وأشهر. تجميع نظام مفاعل الضغط العالي مضيعه للوقت إلى حد ما. ومع ذلك ، عندما العمليات المعقدة والصعبة (الميكروبيولوجية) التي تحدث في أعماق الأرض تحت سطح التربة في السوائل العدوانية كيميائيا يجب التحقيق في المختبر ، مزايا هذا النظام تفوق مساوئ. ووجدت النتائج انه حتى عند الضغط العالي فان اتحاد الميكروبات نشط ، ولكن بمعدلات ايضيه اقل بكثير.
Introduction
وخلال العقد الماضي ، ازدادت الجهود الرامية إلى التقليل إلى ادني حد من اثر التعدين علي البيئة. التعدين حفره مفتوحة لاستخراج المواد الخام من الخامات (علي سبيل المثال ، خامات كبريتيد النحاس الغنية) ، يؤثر علي المناظر الطبيعية المحيطة بها من قبل أنشطه الحفر والاحجام الكبيرة المتبقية من الصخور النفايات وبقايا الخام المصنعة بعد استخراج الثمينة المعادن مثل النحاس. ومن شان استخراج النحاس مباشره من الخام في باطن السطح ان يقلل كثيرا من هذه الآثار. وتكنولوجيا البيولوجيا في الموقع هي مرشح واعد لهذه العملية1. يصف هذا المنشور استخدام النشاط الميكروبي المحفز لاستخراج المعادن النفيسة من الخام إلى محلول مائي في باطن السطح. التالي ، يمكن ضخ حل غني بالنحاس بسهوله مره أخرى إلى السطح لزيادة تركيز المعدن ، علي سبيل المثال.
وقد درس نشاط الكائنات الدقيقة اسيدوفيليك الرشح الخام في العديد من المختبرات لمجموعه متنوعة من المعلمات2,3,4,5,6. ومع ذلك ، اثار الضغط علي النشاط الميكروبي الناجمة عن الفرق بين الظروف مختبر السطح المحيط (بالقرب من 1 بار) وتحت سطح الأرض علي عمق 1,000 م مع الظروف الهيدروستاتيكي (~ 100 بار) ، ليست موثقه توثيقا جيدا. ولذلك ، تم التحقيق في اثار الضغط علي التقليل من الحديد الميكروبي من خلال مختلف الطرق التجريبية7. هنا ، يتم وصف التقنية الأكثر ملاءمة بالتفصيل.
وقد استخدمت مفاعلات الضغط العالي علي نطاق واسع لدراسة ردود الفعل علي الضغوط ودرجات الحرارة التي تحدث في باطن الأرض. وتتكون هذه المفاعلات من سفينة مفاعل في القاع يمكن ان تحتوي علي عينه سائله ذات ثقافة جرثوميه. ويوفر راس المفاعل ، الذي يجلس فوق سفينة المفاعل ، مجموعه متنوعة من الوصلات والواجات لتدابير السلامة وأجهزه استشعار الرصد (مثل درجه الحرارة أو الضغط). معظم المفاعلات عاليه الضغط مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدا. هذه المواد توفر مرونة عاليه وخصائص آلات جيده ، ولكن مقاومه التاكل من سطح الفولاذ المقاوم للصدا ليست كافيه لكل تطبيق. علي سبيل المثال ، إذا تم التحقيق في المحاليل المائية الحمضية أو الشديدة الانخفاض ، قد تحدث ردود فعل هامه للمركبات ذات الاهتمام بجدار المفاعل. طريقه واحده لتجنب هذا هو ادراج بطانة في سفينة المفاعل ، علي سبيل المثال بطانة مصنوعة من زجاج بوروسيليكات7. فمن السهل لتنظيف ويمكن تعقيمها عن طريق التعقيم. الاضافه إلى ذلك ، فانه لا يهاجم من قبل الحمضية أو الحد من المحاليل المائية. علي الرغم من ان بطانة يمكن ان تساعد علي منع التفاعلات الاصطناعية للحل أو الميكروبات في الحل مع جدار المفاعل الفولاذ المقاوم للصدا ، لا تزال هناك عده مشاكل. لأحد ، إذا تم تشكيل غاز التاكل ، مثل كبريتيد الهيدروجين التي تنتجها البكتيريا التي تقلل من كبريتات ، وهذا الغاز قد تتفاعل مع السطح المكشوف لراس المفاعل يجلس فوق البطانة. والعيب الآخر هو انه ليس من الممكن سحب عينه من المفاعل مع الحفاظ علي الضغط.
للتغلب علي هذه القيود ، تم تطوير خلايا التفاعل المرنة المتخصصة داخل مفاعلات الضغط العالي لمجموعه متنوعة من التطبيقات. تم تصميم خليه تترافلوروايثيلين مرنه (PTFE)8 لدراسات الذوبان في الأملاح في المحاليل الملحية عاليه الملوحة. ومع ذلك ، فان الحد من هذا النظام هو ان بعض الغازات يمكن ان تتخلل بسهوله PTFE. الاضافه إلى ذلك ، لا تزال هذه المواد لديها استقرار درجه حرارة منخفضه نسبيا. وهكذا ، تم تحسين النظام عن طريق تصميم حقيبة ذهبيه مرنه مع رئيس التيتانيوم9 لوضعها داخل مفاعل الفولاذ المقاوم للصدا عاليه الضغط. سطح الذهب هو مقاومه للتاكل ضد الحمضية أو الحد من الحلول والغازات. سطح التيتانيوم هو أيضا خاملة للغاية عندما تخفته تماما لتشكيل طبقه ثاني أكسيد التيتانيوم المستمر. اثناء أخذ العينات من هذه الخلية رد الفعل من خلال أنبوب أخذ العينات التيتانيوم متصلة ، يتقلص كيس الذهب في الحجم. يتم الحفاظ علي الضغط الداخلي للنظام عن طريق ضخ نفس الحجم من الماء ، كما يتم سحبها عن طريق أخذ العينات ، في مفاعل الفولاذ المقاوم للصدا عاليه الضغط استيعاب خليه رد الفعل. يتم الاحتفاظ بالعينة داخل خليه رد الفعل في الحركة عن طريق هزاز أو أماله مفاعل الضغط العالي بأكثر من 90 درجه خلال التجربة.
تتكون خليه رد الفعل من الأجزاء المبينة في الشكل 1: الحقيبة الذهبية ، طوق التيتانيوم ، راس التيتانيوم ، غسالة الفولاذ المقاوم للصدا ، حلقه ضغط التيتانيوم الترباس ، أنبوب أخذ العينات التيتانيوم مع الغدد المقاوم للصدا والياقات لضغط عاليه اتصالات مترابطة علي كلا الجانبين ، وصمام التيتانيوم. الحقيبة الذهبية هي الذهب أسطواني (Au 99.99) الخلية مع سمك الجدار من 0.2 ملم ، والقطر الخارجي من 48 ملم ، وطول 120 ملم.
جميع أجزاء التيتانيوم مصنوعة خصيصا من قبل ورشه عمل من قضبان التيتانيوم الصف 2. ابعاد طوق ، الراس ، غسالة ، وضغط حلقه الترباس مرئية في الشكل 2. أنبوب أخذ العينات التيتانيوم هو الشعرية من التيتانيوم مع القطر الخارجي من 6.25 ملم وسمك الجدار من 1.8 مم ، مما ادي إلى القطر الداخلي من 2.65 ملم. وهو ثابت في الراس التيتانيوم وصمام التيتانيوم بواسطة الضغط العالي coned والوصلات المترابطة ضمان ختم التيتانيوم مقابل التيتانيوم السطوح. وقد تم تجهيز صمام التيتانيوم عاليه الضغط مع جذع فتح بطيئه للسماح لفتح السيطرة جدا أو أخذ العينات حتى في الضغط العالي. استعملت هذا نظامه كان في يتعدد دراسات10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكانت الطريقة المعروضة لتجارب الضغط العالي للتفاعلات الميكروبية داخل المحاليل الحمضية أداه قويه لمحاكاة العمليات الجيولوجية الجوفية العميقة في بيئة مختبريه.
وهناك العديد من الخطوات اليدوية التي ينطوي عليها العمل ، وبعضها يتطلب اهتماما خاصا. وكملاحظه عامه ، لا يجب استخدام القوه المفرطة عند تجميع الأجزاء الفردية من الخلية المرنة للذهب والتيتانيوم وراس المفاعل (القسمان 3 و 4). إذا تم تجاهل مواصفات الشركة المصنعة (علي سبيل المثال ، لاقصي قدر من الضغط ، ودرجه الحرارة ، وعزم الدوران) ، قد يؤدي التسرب و/أو الفشل المادي.
تنظيف أجزاء الذهب والتيتانيوم (القسم 2.2) هو خطوه عمل لا غني عنها ، ليس فقط لهذه التجربة ، ولكن خاصه بالنسبة للتجارب التي تنطوي علي (في-) ردود الفعل العضوية. بقايا من التجارب السابقة في الخلية الذهبية قد يسبب ردود فعل غير مرغوب فيها ، التالي التجعيد من النتائج. عندما يتم تركيب خليه الذهب التيتانيوم تجميعها في راس المفاعل ، فمن الأفضل للعمل بسرعة وعلي وجه التحديد ، لأنه في هذا الوقت كميات صغيره من الأكسجين يمكن ان تدخل الخلية الذهبية. إغلاق صمام أخذ العينات قبل مغادره قفازات هو التدبير الأول الجيد للتقليل من التبادل بين الغلاف الجوي المحيط مع الداخل من الخلية الذهبية.
بمجرد وضع المفاعل في جهاز هزاز ، من المهم تعيين سرعه الحركة الهزازة إلى ~ 170 °/min. إذا كان مفاعل الضغط العالي يتحرك بسرعة كبيره ، قد يحدث تمزق في الخلية الذهبية بسبب تاثيرات الجاذبية أو الحواف الحاده لرواسب أو عينات الصخور عند استخدامها.
يمكن استخدام هذه الطريقة في حقول بحث اضافيه. ان الخلية المرنة للتفاعل بين الذهب والتيتانيوم لديها القدرة علي استخدامها في مجموعه متنوعة من التحقيقات العلمية9 دراسة ردود الفعل في الضغط المرتفع ودرجه الحرارة وفي السوائل أو الغازات عاليه التاكل.
الكائنات المجهرية في أعماق السطح في درجات حرارة فوق 70 درجه مئوية في وجود الأسطح المعدنية قد تحفز إنتاج الهيدروجين الجزيئي أو الأحماض العضوية مثل خلات حتى تحت ضغط مرتفع16. هذه المنتجات ، وغيرها من المركبات ، قد تحفز النشاط الميكروبي المرتفع اثناء عمليات المعالجة البيولوجية في الموقع ، بالاضافه إلى مركبات الكبريت التي تم التحقيق فيها في هذه الدراسة.
وتشمل التطبيقات تحديد قابليه ذوبان الغازات والأيونات في السوائل المائية ، والتفاعلات الكيميائية الجيولوجية في ظروف أنظمه التنفيس الحرارية17، والكمية من تجزئه النظائر18، والتفاعلات الكيميائية الجيولوجية خلال CO 2 تنحيه19، العمليات اللااحيائيه اثناء تشكيل النفط والغاز في الصخور المصدر20، وردود الفعل الميكروبية في الضغوط المرتفعة في تحت السطح21 كما في هذه الدراسة.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر روبرت روزنباور (USGS, Menlo Park) في تقاسم خبرته في خلايا التفاعل الذهب التيتانيوم مرنه, وجورج Scheeder (المعهد الفيدرالي) لمساهمته خلال المرحلة الاوليه من اعداد النظام المعدل في هانوفر. ونود ان نشكر العديد من العلماء (بما في ذلك كاتيا Heeschen ، اندرياس ريس ، ينس غروغر-Trampe ، ثيودور الدائم) باستخدام الاعداد في هانوفر في العديد من المشاريع التي ساهمت في التحسينات قليلا علي طول الطريق والمسيحي Seeger لتطوير جهاز هزاز لمفاعلات الضغط العالي. نشكر لورا كاسترو (جامعه كومبلوتنسي في مدريد) علي ملاحظات SEM. وأخيرا ، نود ان نعرب عن امتناننا ل Nils Wölki لإنتاج هذا الفيديو عاليه الجودة لهذه المادة. وقد دعم هذا العمل الاتحاد الأوروبي الأفق 2020 المشروع البيولوجية (المنح الاتفاق # 642456).
Materials
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
Referanslar
- Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8 (3), 165-166 (2015).
- Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (3), 1435-1449 (2014).
- Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20 (6), 903-913 (2016).
- Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
- Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
- Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
- Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
- Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261 (1), 61-78 (1963).
- Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64 (5-6), 646-649 (1979).
- Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35 (4), 393-404 (2004).
- Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48 (2), 1306-1314 (2014).
- Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
- Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101 (4), 739-750 (2008).
- Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (7), 1536-1540 (1987).
- Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39 (3), 219-222 (2011).
- McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113 (49), 13965-13970 (2016).
- Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
- Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
- Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27 (7-8), 477-496 (1997).
- Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11 (12), 3140-3153 (2009).
