המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

1. עיצוב תבניות דוגמת מילוי הערה: תבניות להרטוט נוצרות עם תוכנת ציור דיגיטלי (טבלת חומרים). רישום ברמות אפורות שונות יקבע עוצמות לייזר. שימוש בתוכנה לעיצוב תבניות תבנית מאפשר יצירה מהירה של תבניות עם גיאומטריה רצויה ומעברי צבע (איור 3). צייר באופן דיגיטלי את תבנית התבנית הרצויה באמצעות תוכנת ציור. בחר גודל התמונה של 1824 פיקסלים אורך ו 1140 הרוחב פיקסלים (אשר במחקר זה מתאים 415 יקרומטר אורך and 260 יקרומטר רוחב). שמור את תבנית התבנית כקובץ Tiff של 8 סיביות.הערה: פרוטוקול צעד-אחר-צעד להפקת תבניות זמין על פי בקשה למותג המסחרי את הציוד המיקרוקול (טבלת חומרים). 2. ניקוי פלזמה הערה: התוצאות האופטימליות דורשות ניקוי פלזמה של המשטחים לפני הפרינינג, אשר יסיר את כל החומר האורגני ויפעיל את המשטח. במקרה הנוכחי, אוויר סביבתי מספיק עבור הפעלת פני השטח. מנקה פלזמה (טבלה של חומרים) שימש עם לחץ התהליך של 1000-1300 mTorr וכוח של 29.6 W עבור 1-5 דקות. השימוש בתחתית הזכוכית מאכל/es עם 20 מ”מ בגודל הפנימי ועובי זכוכית של 0.16-0.19 mm. לבדיקת תנאים מרובים, להשתמש בצלחת 6-היטב זכוכית בתחתית. אחרת, השתמש בצלחת אחת בתחתית הזכוכית (טבלת חומרים).הערה: פרוטוקול שלב אחר שלב לניקוי פלזמה זמין על פי בקשה למותג המסחרי את ציוד הניקוי הפלזמה (לוח חומרים). 3. פסיבציה הערה: שלב זה יוצר סרט אנטי-כסות המונע ספיחה של חלבונים למשטח הזכוכית. פג מציעה עמידות גבוהה לספיחה חלבון29 כסוכן מנוגד. LIMAP משתמשת ביוזם צילום כדי להסיר את פג באופן מקומי באמצעות תמונות UV. חלבון/s של עניין אז ספוח אלה משטחים ללא יתד21, יצירת מיקרו דפוסים. פסיבציה עם PLL-יתד בתנאים סטריליים, חותכים את הסטנסילים של PDMS (ראה איור 4א, ב וטבלה של חומרים) כדי להבטיח שהם מתאימים בתחתית הזכוכית הפנימית היטב, ולהסיר את הסתימות מיקרו היטב הפנימי עם מלקחיים סטרילי. מקל סטנסילים על הזכוכית היטב באמצעות מלקחיים. ודא כי הסטנסילים מקל היטב על הזכוכית, מניעת היווצרות בועות אוויר שיכול לגרום דליפות במהלך תהליך פסיבציה.הערה: הסטנסילים pdms יכול גם להיות מפוברק בתוך הבית באמצעות פרוטוקולים שפורסמו18,32. הכינו את התמיסה PLL-יתד (טבלת חומרים, 0.1 Mg/mL) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS). הוסף 20 μL של פתרון PLL-יתד לכל מיקרו-היטב ו דגירה בטמפרטורת החדר, עבור 1 h. הסרת 15 μL של PLL-יתד מן המיקרו-בארות ולשטוף אותם חמש פעמים עם 20 μL של PBS (טבלת חומרים) מבלי לאפשר להם להתייבש.הערה: תמיד לעזוב כ 5 μL של PBS בין שוטף. בהתחשב בנפח הקטן שלהם, המיקרו-בארות רגישים במיוחד לייבוש. ייבוש יביא מיקרו דפוסים של איכות ירודה. או לשמור את הצלחת התרבות ב-PBS (3 מ ל) ב 4 ° צ’ עד 3 ימים או להמשיך עם השלב הבא (שלב 3.1.5). הסרת 18 μL של PBS ממיקרו-באר יחיד (לדוגמה, השמאלית העליונה מיקרו-טוב, ראה איור 4D), להוסיף 5 μl של צילום יוזם (plpp, טבלה של חומרים) ולהשאיר 20 μl של PBS במיקרו בארות הנותרים. זה מיקרו היטב עם PLPP ישמש כדי ליצור דפוס התייחסות (ראה איור 4ד, E) במהלך שלב כיול המערכת (שלב 4). לשמור על PLPP מוגן מפני אור. פסיבציה עם שימור ארוך של יתד-SVAהערה: כדי ליצור את המשטח נגד הדבקה אחד יכול להשתמש: 1) יתד מקושר ל פולי-L-ליזין (PLL-יתד, שלב 3.1) או 2) יתד-סוסיטה N-הידרוקסינימיד (יתד-SVA). ההחלטה לבחור אחת מהאפשרויות הפסיבציה תלויה באפשרויות האחסון (ראה שלב 10). מנות תרבות מודבלות עם יתד-SVA דורשים כמות כפולה של פסיבציה ו פוטוatning זמן. הכן סטנסילים כמתואר בשלב 3.1.1. הוסף 20 μL של 0.01% פולי-L-ליזין (PLL, טבלה של חומרים) לכל מיקרו-היטב ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות כדי pre-מעיל עם pll. הסרת 15 μL של PLL מתוך מיקרו בארות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 20 μL של מאגר HEPES 1 M (טבלת חומרים) מבלי לאפשר לבארות להתייבש.הערה: תמיד להשאיר כ 5 μL של HEPES או PBS בין שוטף. בהתחשב בנפח הקטן שלהם, המיקרו-בארות רגישים במיוחד לייבוש. ייבוש יביא מיקרו דפוסים של איכות ירודה. הכן את פתרון יתד-SVA. יתד-SVA פתרון (50 mg/mL ב HEPES מאגר 1M) צריך להיות מוכן טרי בכל פעם לפני השימוש. הכינו 20 μL של יתד-SVA לכל מיקרו-באר. מאגר HEPES חייב להיות pH בין 8-8.5. בדיקת HEPES pH לפני הכנת הפתרון יתד-SVA עם נייר pH. שוקלים יתד-SVA בצינור צנטריפוגה באמצעות סולם דיוק. הוסף מאגר HEPES ו מערבולת 30 s עד התפרקה. יתד-SVA הוא התפרקה לחלוטין כאשר הפתרון הוא שקוף.הערה: SVA הוא אסתר המאפשרת קשירה של פג אל PLL מצופה בעבר. לאחר מאגר HEPES מתווסף ל-יתד-SVA, SVA יש מחצית חיים של 15 דקות ויש להשתמש בו מיד. הוסף 20 μL של הפתרון יתד-SVA לכל מיקרו-היטב ומארג בטמפרטורת החדר, עבור 1 h. הסר 15 μL של יתד-SVA מתוך מיקרו בארות ולשטוף חמש פעמים עם 20 μL של PBS (טבלת חומרים) מבלי לתת לבארות להתייבש. הכינו את קערת התרבות לאחסון לטווח ארוך (עד 1 חודש, ראה שלב 10.2) או המשך לשלב הבא (שלב 3.2.8). הסרת 18 μL של PBS ממיקרו-באר יחיד (לדוגמה, השמאלית העליונה מיקרו-טוב, ראה איור 4D), להוסיף 5 ΜL של Plpp (טבלת חומרים) ולעזוב 20 μl של PBS במיקרו בארות הנותרים. זה מיקרו היטב ישמש כדי ליצור דפוס התייחסות (ראה Fi יקח 4d, E). ודא כי PLPP הוא הומוגנית על פני השטח כולו של מיקרו-באר. לשמור על PLPP מוגן מפני אור. 4. כיול מערכת הערה: בשלבים אלה, מוקד הלייזר יותאם לסוג מסוים של כלי תרבות (שלב 4.1). דפוס התייחסות ייווצר רק אחד מיקרו-באר (שלב 4.2) ואחריו דגירה עם פתרון חלבון (שלב 4.3) כדי להבטיח את תנאי המיקוד האופטימלי של הלייזר (שלב 4.4), הכרחי כדי לקבל דפוסים חדים ומוגדרים. כיול לייזרהערה: במהלך תהליך הכיול, תמונת לייזר של כיול תועלה על פני משטח זכוכית מסומן (כיול היטב, מסומן בסימון פלורסנט, איור 4ג), שצריך להניחה בפוקוס על ה מיקרוסקופ. השתמש בסימון פלורסנט (טבלת חומרים) כדי לסמן היטב זכוכית פנימית ריקה.הערה: לכיול היטב חייב להיות עובי זכוכית זהה (0.16-0.19 mm) כמו תבשיל התרבות שעליה מיקרו תבניות ייווצרו. אם הצלחת 6-היטב זכוכית בשימוש, ניתן להשתמש בבאר ריקה לכיול ויש לסמן עם עט פלורסנט בתנאים סטריליים. , הפעל את המיקרוסקופ. הבמה והמחשב הפעל את ציוד ה-פרימו המיקרו-מיקרו, פתח את תוכנת מיקרו-מנג ותוכנה לאונרדו. תוכנת לאונרדו מופעלת באמצעות מיקרו-מנהל תחת תוספים. בדוק את המותגים/קטלוג מספרים של ציוד ותוכנה ברשימת חומרים. בתפריט ההתחלתי של לאונרדו, בחר באפשרות כיול. בדוק שקוביית הסינון הייעודית של פרימו נמצאת במיקום הנכון (נתיב אופטי) בצריח המסנן; בחר את המטרה 20X (0.75 DIC S תוכנית Fluor, לא טבעת שלב) הן על המיקרוסקופ ועל תוכנת לאונרדו.הערה: פרוטוקול זה מותאם לגרסה 4.4 של לאונרדו. ייתכן שהפרוטוקול יצטרך להתאים לגירסאות אחרות. הצב את הכיול המסומן בעבר היטב (איור 4ג) מעל המטרה. בחר נתיב מצלמה. להתאים את המוקד האובייקטיבי עד הקרנת הלייזר של שני הלוגו פרימו ואת קו התגים לטפל התאים שלך נמצאים בפוקוס. השאירו זמן חשיפה של מצלמת ברירת מחדל ב-25 ms. כוונן את עוצמת הלייזר כדי לראות את האות I מהטלה הלוגו הפרימו בצבע אפור ושאר האותיות בלבן. הקלט את מיקום Z של המישור המוקד, (גובה המטרה למדגם) התייחס מאוחר יותר ל-Z-מיקום הכיול. זה יהיה קירוב למוקד האופטימלי שהושג לאחר התייחסות הדור דפוס (ראה שלב 4.2-4.4). תבנית אסמכתא מיקום צלחת התרבות עם מיקרו-גם המכיל את התמונה יוזם (דפוס התייחסות מיקרו-טוב, איור 4ד) מעל המטרה ולבחור דפוס עכשיו בתוכנה לאונרדו. המחש את קצה המיקרו-באר עם אור משודר דרך המצלמה ובחר בסמל הROI מהתפריט הימני. הגדר את קוטר המעגל roi כדי 4000 יקרומטר וליישר את הקצה של ההחזר הדיגיטלי עם קצה של המיקרו-באר הנוכחי. ודא שיש חפיפה מדויקת בין ההחזר הדיגיטלי למיקרו-באר הנוכחי על-ידי הזזת השלב סביב הקצוות של המיקרו-באר. תנוחת ההחזר תהיה משולב לתנועות הבמה. בחר לנעול בתוכנת לאונרדו כדי לנעול את ההחזר במיקום הרצוי. . כבה את האור המשודר בחר פרימו כדי להעלות את תבנית התבנית הרצויה, שתהיה מוקרנת על ה-ROI כיחידת עיצוב (ראה איור 5). תבניות יופיעו ברשימה נפתחת הנקראת פעולות ומוצגות בתפריט פעולות בתוכנה.הערה: יש לתכנן תבניות תבנית בעבר (ראה שלב 1) ולשמור כקובץ Tiff של 8 סיביות לפני טעינת התבנית בתוכנה. נדרשת תבנית קטנה בלבד עבור תבנית הייחוס; לדוגמה, 3 שורות, עמודה אחת (ראה איור 4E ואיור 5ב). בתפריט השכפול , הגדר את המספר הרצוי של עמודות ושורות (שורות בתוכנת לאונרדו). לחץ על ‘ רענן ‘ כדי לצפות בתצוגה מקדימה דיגיטלית של עיצוב דוגמת המילוי. הגדר את מינון הלייזר בתפריט השכפול . מינון לייזר אופטימלי בהגדרה זו באמצעות PLL-יתד הוא 1390 mJ/mm2.הערה: כוח לייזר יכול להשתנות בין 5-7.5 mW/mm2. במקרה זה, זה 7.5 mW/mm2, אשר לוקח כ 30 s כדי תבנית כל יחידת עיצוב, באמצעות מינון לייזר של 1390 mJ/mm2. מינונים גבוהים יותר של לייזר עשוי להידרש אם משטח צלחת התרבות הוא פסיב עם יתד-SVA (כמות לייזר כפולה בהשוואה ל PLL-יתד). . צריך לבדוק את זה מראש נווטו לאזור היקפי של המיקרו-באר, (לדוגמה, חלק עליון) הרחק מהאזור העיקרי של העניין ליצירת תבניות (אזור מרכזי) של המיקרו-באר (ראו איור 4E) ובחרו ‘ נעל’. המתן עד להצגת התבנית. כוונן את המוקד אל מיקום Z של הכיול (ראה שלב 4.1.6).הערה: מומלץ לבצע שלב נוסף של כיול מערכת אם משתמש אחר משתמש במיקרוסקופ זהה בין סיבובים photopatterning. בחר את סמל ההפעלה כדי להתחיל בהצגה. ודא שהלייזר מופעל בתוכנה. המתן עד לסיום תהליך הגימור. משך התצוגה יוצג בחלונית ‘ זמן משוער ‘. בגרסת התוכנה של לאונרדו 4.4 הדמיה מסתיימת כאשר כל הפעולות מופיעות כחולות בתפריט החזותי. דגירה של חלבון בדפוס התייחסות תחת תנאים סטריליים, לשטוף את תבנית הייחוס מיקרו-טוב שלוש פעמים עם 20 μL של PBS כדי להסיר את PLPP. הוסף 20 μL של חלבון ECM מתויג בצורה פלואורומטר (10 μg/mL למינציה, פילברון או פיברינוגן ב-PBS, ראה טבלת חומרים וצעד 6) לתבנית ההתייחסות מיקרו-באר. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 10-20 דקות (בהתאם לחלבון) מוגן מפני אור (לעטוף את הצלחת ברדיד אלומיניום). לאחר דגירה, להסיר 18 μL של פתרון חלבון ולשטוף שלוש פעמים עם 20 μL של PBS; לשמור על מיקרו בארות שאינם משמשים כדי ליצור דפוס התייחסות (ראה איור 4ד, E) ב 20 μl של PBS. הדמיה והגדרה של מוקד לייזר אופטימלי להמחיש את דפוס ההתייחסות באמצעות מיקרוסקופ אפידלנטית, המטרה 20X ותוכנה מתאימה (לבדוק את התוכנה בשימוש במחקר זה בטבלה של חומרים). תבנית ההתייחסות צריכה להיות גלויה באזור ההיקפי (לדוגמה, אזור הבאר העליון), שבו נוצרה תבנית ההפניה (ראה איור 4E). כוונן את המיקוד בקצות התבנית דרך נתיב המצלמה. הקלט את מיקום Z בהתאם למיקוד הטוב ביותר בתבנית ההפניה. מיקום Z מותאם זה יהיה מוקד הלייזר האופטימלי המשמש לצורך המשך הפעולה הבאה. 5. הגדרת תוכנה ופוטוטרנינג הערה: לאחר כיול המערכת הושג (שלב 4), המשתמש יעלה את תבניות התבנית הרצויות (תצורת תבנית, איור 5) עבור photopatterning, עם אפשרות ליצור דפוסים עבור חלבונים אחד או מספר מרובים בכל מיקרו-טוב. תהליך מיקרו-הדנינג כרוך בתהליכי דגירה ושלבי אינקובציה של חלבונים (ראה איור 2). תחת תנאים סטריליים, להסיר 18 μL של PBS מכל מיקרו בארות ולהוסיף 5 μL של PLPP לכל מיקרו-באר. ודא כי PLPP הוא הומוגנית על פני השטח כולו של מיקרו-בארות. מקמו את קערת התרבות עם תבנית ההתייחסות מיקרו-טוב (איור 4D, E) מעל המטרה ולבחור דפוס עכשיו בתוכנה לאונרדו. המחש את המיקרו-באר עם אור משודר דרך נתיב המצלמה ובחר בסמל הROI. להגדיר את קוטר ההחזר של התשואה כדי 4,000 יקרומטר וחופפים את הקצה של ההחזר הדיגיטלי לקצה של מיקרו-באר הנוכחי. בחר נעילה.הערה: הצורה והקוטר של ה-ROI תלויים בעיצוב ובגודל של סטנסיל PDMS הנמצא בשימוש. לדוגמה, אם באמצעות 5,000 x 5,000 יקרומטר pdms בריבוע סטנסילים, להשתמש 5,000 x 5,000 יקרומטר בריבוע ROI. חזור על השלב החופף (שלב 5.3) עבור כל מיקרו-באר של המנה. עם סיום הביצוע, כבה את האור המשודר. נווט אל מרכז תבנית הייחוס מיקרו-טוב, הרחק מאזור תבנית הייחוס, ובחר פרימו כדי להעלות את תבנית התבנית הרצויה, אשר תהיה מוקרנת על ROI כיחידת עיצוב (ראה איור 5). תבניות יופיעו ברשימה נפתחת הנקראת פעולות ומוצגות בתפריט פעולות בתוכנה.הערה: תבניות תבנית צריכות להיות מתוכננות לפני הניסוי ונשמרות כקובץ Tiff של 8 סיביות לפני טעינת התבנית בתוכנה. על מנת ליצור תבנית לאורך כל המיקרו-באר, יש לשכפל את יחידת העיצוב. יחידת עיצוב מכסה סביב 0.1 מ”מ2 של אזור מיקרו-באר. בתפריט השכפול , הגדר את המספר הרצוי של עמודות ושורות (קווים בתוכנה) (ראה איור 5). כדי ליצור תבנית רציפה, התאם את הריווח בין עמודות וקווים; במחקר זה, דפוסים של פסים רציפים מתקבלים באמצעות-20 עד-35 יקרומטר מרווח (מרווח שלילי) בין עמודות. ריווח שלילי זה יוצר חפיפה בין יחידות עיצוב (איור 5ב, ג). הגדר את מינון הלייזר בתפריט השכפול . מינון לייזר אופטימלי בהגדרה זו באמצעות PLL-יתד הוא 1390 mJ/mm2. משך התצוגה יוצג בלוח הזמן המשוער .הערה: במקרה זה כוח לייזר הוא 7.5 mW/mm2, נטילת כ 30 s לתבנית כל יחידת עיצוב, באמצעות מנה של 1390 mJ/mm2. לדוגמה, יחידת עיצוב (0.1 mm2) משוכפל ב 4 עמודות ו 4 שורות (סביב 1.6 mm2), ייקח 8 דקות להיות בדוגמת. מינונים גבוהים יותר של לייזר עשוי להידרש אם משטח צלחת התרבות הוא פסיב עם יתד-SVA (כמות לייזר כפולה בהשוואה ל PLL-יתד). בחר באפשרות ‘ נעל ‘ והמתן עד שהתבנית מוצגת כמעט. כדי לעדכן את הפרמטרים של תבנית, לחץ על הפעולההקשורה ולאחר מכן בטל את נעילת ועדכן את הפרמטרים. בחר באפשרות Lock שוב לאחר השלמת עדכון התבנית. הדפוס של חלבונים מרובים באותו מיקרו היטב (סיבובים מיקרו המטחים רציפים) דורש יישור מדויק של דפוסי. כדי להשיג יישור כזה, להעלות את כל ערכות של תבניות הרצוי בו (דפוסים של סיבובים photopatterning הראשון והשני). הגדר את פרמטרי השכפול והמינון של תבניות התבנית. לאחר הגדרת הפרמטרים, תבניות יופיעו כפעולות ברשימת הפעולות . שמור תצורת תבנית זו כקובץ בתוכנה (ראה איור 5ד). ברשימה פעולות , בחר רק את הפעולות הספציפיות שיהיו בתבנית במהלך הסיבוב הראשון ובטל את הבחירה בפעולות שיהיו בתבנית במהלך הסיבוב השני (ראה איור 5ד). נווט לאזור שבו תבנית ההפניה הופקה בשלב 4.2 (לדוגמה, האזור העליון של תבנית ההפניה מיקרו-טוב, ראה איור 4E). כוונן את המוקד למיקום Z האופטימלי (מתקבל בשלב 4.4).הערה: מומלץ מאוד לבחור מערכת המיקוד המושלמת על המיקרוסקופ שנעשה בו שימוש (אם זמין), אשר מבטיח כי מיקום Z האופטימלי עבור המרכז יהיה נשמר בכל תהליך photopatterning כולו. בחר את סמל ההפעלה כדי להתחיל בהצגה. משך התצוגה יוצג בחלונית ‘ זמן משוער ‘. בגרסת התוכנה של לאונרדו 4.4 הדמיה מסתיימת כאשר כל הפעולות מופיעות כחולות בתפריט החזותי . 6. דגירה של חלבון הערה: מיקרו-בארות מודוגות עם חלבונים ECM (רצוי מתויג באמצעות פלואורוסקופים). אלה יהיה רק לאגד את האזורים שבהם פג היה ביקע באמצעות תהליך photopatterning המתואר בשלב 5. כל טוב מכיל סטנסיל PDMS עם 4 מיקרו-בארות, אשר יאפשרו בדיקה 4 מצבים שונים בו זמנית, למשל, דגירה של חלבון שונה בכל מיקרו-באר (ראה איור 4ד). השתמש בחלבונים בעלי תוויות פלואורוסקופים (לדוגמה, למינציה, fibronectin או פיברינוגן מצופף אדום או ירוק fluorophores) על מנת להמחיש את דפוסי מיקרו (ראה שלב 6.7 ו 9.4). לחילופין, חלבונים ללא תווית נספחת יכול להיות דמיינו בשלבים מאוחרים יותר באמצעות immunofluorescence.הערה: חלבונים ECM (לדוגמה, fibronectin) ניתן לתייג באמצעות פרוטוקולים קיימים33 ו מסחרית זמינים ערכות תיוג הקרינה (כלומר, אלקסה 488 ערכת תיוג), או לרכוש בקלות בתווית (למשל, במצועית fiברינוגן-488 או הפלורסנט הלמינציה-אדום, ראו טבלת חומרים). בתנאים סטריליים, להכין את הריכוז הרצוי של חלבונים ECM (10 μg/mL למינציה, fibronectin או פיברינוגן ב-PBS, ראה לוח חומרים וצעד 4.3).הערה: פלואור מתויג חלבונים ECM הם רגישים באור, צריך להיות מוגן מפני אור (צלחת לעטוף ברדיד אלומיניום) ויש לשמור על קרח בכל עת. בתנאים סטריליים, לשטוף את מיקרו בארות שלוש פעמים עם 20 μL של PBS כדי להסיר את PLPP. הסרת 18 μL של PBS מכל מיקרו-בארות ולהוסיף 20 μL של פתרון חלבון ECM לכל מיקרו-באר. דגירה בטמפרטורת החדר, עבור 20-30 דקות ולהגן מפני אור.הערה: שעות דגירה של ציפויים אופטימליים עשויות להשתנות בהתאם לסוג ולריכוז החלבונים. לאחר הדגירה, להסיר 15 μL של פתרון חלבון ECM ולשטוף את מיקרו בארות שלוש פעמים עם 20 μL של PBS.הערה: תמיד לעזוב כ 5 μL של PBS בין שוטף. אם מדובר רק בחלבון אחד (סיבוב אחד של מיקרו-מיקרונג), המשך לאחסון המנה התרבותית (שלב 10) או לציפוי תאים (שלב 11, וראה איור 2). אם ביצוע סיבוב שני של מיקרו-מחשב עם חלבון שונה באותו מיקרו-באר, להמשיך או לאחסון של צלחת התרבות (שלב 10) או כדי לחסום אתרי איגוד מסוימים (שלב 7, ולראות איור 2). שלב בקרת איכות אופציונלי: הדמיה ודפוסים מודפסים של תמונה באמצעות מיקרוסקופ אפיצילי לפני התאים הציפוי. בחרו ערוצי פלורסנט מתאימים והתאימו את זמני החשיפה בהתאם.הערה: כדי להשוות את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של דפוסים בין ניסויים, חיוני להשתמש באותם זמנים חשיפה עבור חלבונים זהים. 7. חסימת אתרי קשירה לא ספציפיים (רק עבור תבניות חלבון מרובות) הערה: מיקרו-המטנג עם מספר חלבונים באותו מיקרו-היטב כרוך שלבים רציפים (ראה איור 2). סוכן חוסם (PLL-יתד או BSA) מתווסף מיקרו בארות כדי למנוע מחייב צולבות, אשר מתרחשת כאשר חלבון מודלת השני (שלב 9) נקשר חלבון מודמת הראשון (שלב 6), ובכך הימנעות תערובת של חלבונים בתוך דפוסי. תחת תנאים סטריליים, להוסיף 20 μL של PLL-יתד (0.1 mg/mL ב-PBS) או BSA (1% BSA ב-PBS) כצעד חוסם כדי למנוע מחייב צולב.הערה: חסימת היעילות עשויה להשתנות בהתאם לאופי החלבונים הנמצאים בשימוש ולזיקה שביניהם. מומלץ לבדוק הן PLL-יתד ו-BSA כסוכני חסימת מראש (איור 10D-I). הסוכן החוסם של הגנה בטמפרטורת החדר במשך 1 h ולהגן מפני אור. הסרת 15 μL של סוכן חוסם ולשטוף את כל מיקרו בארות שלוש פעמים עם 20 μL של PBS. תמיד להשאיר כ 5 μL של PBS בין שוטף. הסרת 18 μL של PBS מכל מיקרו בארות ולהוסיף 5 μL של PLPP לכל מיקרו-באר, להבטיח כי PLPP הוא הומוגנית על פני השטח כולו של מיקרו בארות. 8. סיבוב שני של פוטואטנינג (רק עבור דפוסי חלבון מרובים) הערה: לאחר סיבוב הראשון של photopatterning והדגירה של חלבון, מיקרו דפוס נוצרת. בסיבוב השני של photopatterning, התבנית עבור החלבון השני ייווצר באותו מיקרו-באר (ראה איור 2C ואיור 5ד). בתוכנה, בחר את תבניות התבנית הנכונות (פעולות), שיהיו מקושטות במהלך סיבוב זה (ראה איור 5ד). נווטו למיקרו-באר הראשון (איור 4ד). ודא חפיפה מתאימה בין ההחזר הדיגיטלי למיקרו-באר. טען את תצורת התבנית שנשמרה בעבר (שלב 5.12) ובחר את הפעולות שיהיו בתבנית במהלך הסיבוב השני של הפוטואטנינג (בטלו את הבחירה בפעולות מסיבוב ראשון, ראה איור 5ד). בחר את סמל ההפעלה כדי להתחיל בהצגה. ודא שהלייזר מופעל בתוכנה. 9. הסיבוב השני של דגירה החלבון (רק עבור דפוסי חלבון מרובים) הערה: בחלק זה של הפרוטוקול, חלבון בעלי תווית שכותרתו/s יהיה מודחים על מנת התרבות לאחר הסיבוב השני של photopatterning. תחת תנאים סטריליים, לשטוף את מיקרו היטב שלוש פעמים עם 20 μL של PBS כדי להסיר את PLPP. הסר 18 μL של PBS ולהוסיף 20 μL של פתרון חלבון ECM לכל מיקרו-באר. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20-30 דקות ולהגן מפני אור.הערה: שעות דגירה של ציפויים אופטימליים עשויות להשתנות בהתאם לסוג ולריכוז החלבונים. לאחר הדגירה, להסיר 15 μL של פתרון חלבון ECM ולשטוף את מיקרו בארות שלוש פעמים עם 20 μL של PBS. תמיד להשאיר כ 5 μL של PBS בין שוטף. המשך לאחסון של כלי תרבות (שלב 10) או לציפוי תא (שלב 11 וראה איור 2). שלב בקרת איכות אופציונלי: שימוש במיקרוסקופ אפיציאני, הדמיה ודפוסים מודפסים בתמונה לפני התאים הציפוי. בחרו ערוצי פלורסנט מתאימים והתאימו את זמן החשיפה.הערה: כדי להשוות את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של דפוסים בין ניסויים, חיוני להשתמש באותם זמנים חשיפה עבור חלבונים זהים. 10. אחסנה של מיקרו דפוסים הערה: ניתן לאחסן מיקרו-תבניות עם חלבונים מבוססי האדסורמיטה בשלבים שונים של הפרוטוקול (ראה איור 2). אם מיקרו-דפוס עם חלבונים מרובים, מיקרו דפוסים ניתן לאחסן לאחר הסיבוב הראשון של המיקרו-מיקרו או לאחר שני סיבובים רציפים של מיקרו הדפוס הושלמו (ראה איור 2ב). כאשר פסיב עם PLL-יתד, לאחסן את מיקרו דפוסי ב-PBS (3 מ ל) ב-4 ° c עד 3 ימים. אם צלחת התרבות היה פסיב עם יתד-SVA, מיקרו דפוסים ניתן לאחסן עד 1 חודש. על מנת לעשות זאת, לשטוף מיקרו דפוסי אינטנסיבי עם מים כפולים מזוקקים מזוקק ויבש עם אקדח אוויר סטרילי של ארגון או חנקן, למרות אוויר נורמלי יכול לשמש גם. לאחר ייבוש, מיקרו דפוסי ניתן לאחסן ב 4 ° צ’ עד 1 חודש (צוות התמיכה של מערכת פרימו, תקשורת אישית). 11. ציפוי תאים הערה: במהלך השלבים הבאים, התאים יהיו מצופים בתבשיל התרבות המוכן בדוגמת מיקרו. במחקרים אלה, קו התאים העצבי (תאי CAD) משמש31. עם זאת, ניתן לכוונן פרוטוקול זה כדי ללמוד סוגי תאים אחרים של העניין (התאמת פרוטוקול ציפוי התא כנדרש). להבדיל תאים CAD עבור 48 h באמצעות בידול בינוני (DMEM שיושלם עם 1% גלוטמין, ללא סרום, עם 1% עט/דלקת, ראה טבלה של חומרים). צלחת 1 מ ל של בינוני עם תאים בתוך הזכוכית הפנימית היטב, כיסוי כל מיקרו בארות ומקום את הצלחת התרבות ב 37 ° c, 5% שיתוף חממה2 .