細胞外マトリックスタンパク質に対する細胞応答を研究するためのマイクロパターニングのためのPRIMOシステムを用いてタンパク質の光誘導分子吸着

1. パターンテンプレートのデザイン 注:パターニング用のテンプレートは、デジタル描画ソフトウェア(材料の表)で生成されます。異なる灰色のレベルで描画すると、レーザー強度が決定されます。ソフトウェアを使用してパターン テンプレートを設計すると、任意のジオメトリとグラデーションを使用してパターンを迅速に生成できます (図 3)。 描画ソフトウェアを使用して、目的のパターンテンプレートをデジタルで描画します。1824 ピクセルの長さと 1140 ピクセルの幅のイメージ サイズを選択します (このスタディでは、長さ 415 μm と幅 260 μm に対応します)。パターン テンプレートを 8 ビット Tiff ファイルとして保存します。注:テンプレートを生成するためのステップバイステッププロトコルは、マイクロパターニング装置(材料のテーブル)を商品化するブランドへの要求に応じて利用可能です。 2. プラズマ洗浄 注:最適な結果は、すべての有機物を除去し、表面を活性化するパターニングの前に表面のプラズマ洗浄を必要とします。この場合、周囲空気は表面活性化のために十分である。プラズマクリーナー(材料の表)は、1000-1300 mTorrのプロセス圧力と1-5分間29.6 Wの電力で使用されました。 20mmの内側の井戸サイズと0.16-0.19 mmのガラス厚のガラス底皿/esを使用してください。複数の条件をテストするには、6ウェルガラス底皿を使用します。それ以外の場合は、単一のウェルガラス底皿(材料のテーブル)を使用してください。注:プラズマ洗浄装置を製品化するブランドへの要望に応じて、プラズマ洗浄のためのステップバイステッププロトコル(材料の表)を利用できます。 3. パッシベーション 注:このステップは、ガラス表面へのタンパク質吸着を防ぐ防汚フィルムを生成します。PEGは、防汚剤としてタンパク質吸着29に対して高い耐性を提供する。LIMAP は、フォト イニシエータを使用して、UV フォトシジョンを通じて PEG をローカルに除去します。目的のタンパク質/sは、これらのPEGフリー表面21に吸化し、マイクロパターンを生成する。 PLL-PEG を使用したパッシベーション 無菌条件下では、PDMSステンシル(図4A、B、材料表を参照)を切断して、内側のガラス底部によく収まるようにし、生殖不能鉗子で内側のマイクロウェル充填物を取り除きます。 鉗子を使用してよくガラスにステンシルを貼ります。 ステンシルがガラスによく固く付き、パッシベーションプロセス中に漏れを引き起こす可能性のある気泡の形成を防ぎます。注: PDMS ステンシルは、公開されたプロトコル18,32を使用して社内で製造することもできます。 リン酸緩衝生理食べ物(PBS)にPLL-PEG溶液(材料表、0.1mg/mL)を調製します。各マイクロウェルに20μLのPLL-PEG溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。 マイクロウェルから15μLのPLL-PEGを取り出し、乾燥させることなく20μLのPBS(材料の表)で5回洗います。注:常に洗い出しの間に約5 μLのPBSを残してください。その小さな容積を考えると、マイクロウェルは特に乾燥の影響を受けやすい。乾燥すると、品質の悪いマイクロパターンになります。 培養皿をPBS(井戸当たり3mL)で最大3日間4°Cに保つか、次のステップ(ステップ3.1.5)を続けます。 1つのマイクロウェルから18 μLのPBSを取り外します(例えば、左上のマイクロウェルを参照)、5 μLの光イニシエータ(PLPP、材料の表)を追加し、残りのマイクロウェルに20 μLのPBSを残します。 PLPPを使用したこのマイクロウェルは、システムキャリブレーションステップ(ステップ4)中に参照パターンを作成するために使用されます(図4D、Eを参照)。PLPPを光から保護してください。 長続きがするPEG-SVAとのパッシベーション注:1)ポリL-リジンにリンクされたPEG(PLL-PEG、ステップ3.1)または2)PEG-コハク酸N-ヒドロキシシニミド(PEG-SVA)を使用することができます。どちらか一方または他方のパッシベーション オプションを選択する決定は、ストレージ・オプションによって異なります (ステップ 10 を参照)。PEG-SVAでインキュベートされた培養皿は、2倍のパッシベーションとフォトパターニング時間を必要とします。 手順 3.1.1 で説明するようにステンシルを準備します。 各マイクロウェルに0.01%ポリL-リジン(PLL、材料表)の20 μLを加え、室温で30分間インキュベートし、PLLでプレコートします。 マイクロウェルから15μLのPLLを取り出し、ウェルを乾燥させることなく、1M HEPESバッファー(材料のテーブル)の20 μLで3回洗浄します。注:常に洗い出しの間に約5 μLのHEPESまたはPBSを残してください。その小さな容積を考えると、マイクロウェルは特に乾燥の影響を受けやすい。乾燥すると、品質の悪いマイクロパターンになります。 PEG-SVA ソリューションを準備します。PEG-SVA溶液(HEPESバッファ1Mの50mg/mL)は、使用直前に毎回新鮮に調製する必要があります。マイクロウェルあたり20 μLのPEG-SVAを準備します。 HEPES バッファは 8 ~ 8.5 の間の pH を持つ必要があります。pH紙でPEG-SVA溶液を調製する前にHEPES pHをテストします。精密スケールを使用して遠心管のPEG-SVAの重量を量る。溶かされるまでHEPESバッファーと渦30sを追加します。PEG-SVAは、溶液が透明な場合に完全に溶解します。注:SVAは、以前にコーティングされたPLLへのPEGの結合を可能にするエステルです。HEPES バッファが PEG-SVA に追加されると、SVA の半減期は 15 分で、すぐに使用する必要があります。 各マイクロウェルに20 μLのPEG-SVA溶液を加え、室温でインキュベートし、1時間でマイクロウェルから15μLのPEG-SVAを取り出し、ウェルを乾燥させることなく20 μLのPBS(材料のテーブル)で5回洗浄します。 培養皿を長期保存用に準備するか(最大1ヶ月、ステップ10.2を参照)、または次のステップ(ステップ3.2.8)に進みます。 1つのマイクロウェルから18 μLのPBSを取り出します(例えば、左上のマイクロウェルを参照)、図4Dを参照してください、PLPP(材料の表)の5 μLを追加し、残りのマイクロウェルに20 μLのPBSを残します。このマイクロウェルは、参照パターンを作成するために使用されます(Fi gure 4D、Eを参照)。マイクロウェルの全面にPLPPが均質であることを確認します。PLPPを光から保護してください。 4. システムキャリブレーション 注:これらのステップでは、レーザーの焦点は、培養皿の特定のタイプに調整されます(ステップ4.1)。基準パターンは1つのマイクロウェル(ステップ4.2)のみで生成され、その後タンパク質溶液(ステップ4.3)でインキュベーションを行い、レーザーの最適な焦点条件を確保し(ステップ4.4)、鋭く定義されたパターンを得るために必要です。 レーザーキャリブレーション注:キャリブレーションプロセス中に、キャリブレーションレーザー画像は蛍光ハイライトガラス表面(キャリブレーションウェル、蛍光蛍光蛍光光機でマークされた図4C)に投影され、顕微鏡。 蛍光蛍光灯(材料の表)を使用して、空の内側のガラスをよくマークします。注:キャリブレーションウェルは、マイクロパターンが生成される培養皿と同じガラス厚さ(0.16~0.19mm)でなければなりません。6ウェルガラス底皿を使用している場合は、空の井戸をキャリブレーションに使用することができ、無菌条件下で蛍光蛍光灯でマークする必要があります。 顕微鏡、ステージ、コンピュータのスイッチを入れます。PRIMOマイクロパターニング装置のスイッチ、マイクロマネージャとレオナルドソフトウェアを開きます。レオナルドソフトウェアは、プラグインの下でマイクロマネージャを介して動作します.材料の表の機器やソフトウェアのブランド/カタログ番号を確認してください。 レオナルドの初期メニューで、キャリブレーションを選択します。専用の PRIMO フィルタ キューブがフィルタ タレット内の正しい位置 (光パス) にあることを確認します。顕微鏡とレオナルドソフトウェアの両方で20Xの目的(0.75 DIC Sプランフルー、フェーズリングなし)を選択します。注: このプロトコルは、レオナルドバージョン4.4に調整されています。プロトコルは、他のバージョンの調整が必要な場合があります。 以前に強調表示されたキャリブレーション (図 4C)を目標の上に配置します。カメラパスを選択します。PRIMOロゴとタグラインの両方のレーザー投影が焦点を合わせるまで、目的の焦点を調整します。 デフォルトのカメラの露出時間を 25 ミリ秒のままにして、レーザー強度を調整して、PRIMOロゴ プロジェクションの文字Iを灰色で表示し、残りの文字を白で表示します。 焦点面のZ位置を記録し、後でキャリブレーションのZ位置と呼ばれる(試料に対する目的の高さ)。これは、参照パターンの生成後に得られる最適なフォーカスに近似されます(ステップ 4.2-4.4 を参照)。 参照パターン フォトイニシエータ(参照パターンマイクロウェル、図4D)を含むマイクロウェルで培養皿を目的の上に配置し、レオナルドソフトウェアでパターンを選択します。 カメラを透過した光でマイクロウェルのエッジを視覚化し、右側のメニューからROIシンボルを選択します。ROI 円の直径を 4000 μm に設定し、デジタル ROI のエッジを現在のマイクロウェルのエッジに合わせます。 マイクロウェルのエッジの周りにステージを移動することにより、デジタルROIと現在のマイクロウェルの間に正確な重複があることを確認します。ROI位置はステージの動きに結合されます。 目的の位置にROIをロックするには、[レオナルドソフトウェアでロック]を選択します。透過光をオフにします。 設計単位として ROI に投影される目的のパターン テンプレートをアップロードするには、PRIMOを選択します (図 5を参照)。パターンは、アクションと呼ばれるドロップダウン リストに表示され、ソフトウェアの[アクション] メニューに表示されます。注: パターン テンプレートは、ソフトウェアにテンプレートを読み込む前に、事前に設計し (手順 1 を参照)、8 ビット Tiff ファイルとして保存する必要があります。 参照パターンには小さなパターンのみが必要です。たとえば、3 行、1 列(図 4Eおよび図 5Bを参照)。[レプリケーション]メニューで、必要な列数と行数 (Leonardo ソフトウェアの行)を設定します。[更新]をクリックして、パターンデザインのデジタル プレビューを確認します。 [複製]メニューでレーザー線量を設定します。この設定で最適なレーザー線量とPLL-PEGを使用すると、1390 mJ/mm2です。注:レーザーパワーは5-7.5 mW/mm2の間で変化することができます。この場合、1390 mJ/mm2のレーザー線量を使用して、各設計ユニットをパターン化するのに約30sかかります7.5 mW/mm2です。培養皿表面がPEG-SVA(PLL-PEGと比較して約2倍のレーザー線量)でパッシベートされている場合は、より高いレーザー用量が必要な場合があります。これは事前にテストする必要があります。 マイクロウェルの周辺領域(例えば、上部)をマイクロウェルのパターン生成(中央領域)の主領域から離して(図4Eを参照)、[ロック]を選択します。パターンが表示されるまで待ちます。 キャリブレーションの Z 位置にフォーカスを調整します(ステップ 4.1.6 を参照)。注:別のユーザーがフォトパターニングラウンド間で同じ顕微鏡を使用している場合は、追加のシステムキャリブレーションステップを行うことをお勧めします。 パターニングを開始するには、再生シンボルを選択します。ソフトウェアでレーザーがオンであることを確認します。パターニングプロセスが完了するまで待ちます。パターニング期間は[推定時間]パネルに表示されます。レオナルドソフトウェアバージョン4.4でパターニングは、すべてのアクションがビジュアライゼーションメニューで青色に表示されたときに完了します。 参照パターン上のタンパク質インキュベーション 無菌条件下で、基準パターンマイクロウェルを20μLのPBSで3回洗浄し、PLPPを除去します。 蛍光標識ECMタンパク質(PBSで10μg/mLラミニン、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲン、材料表およびステップ6)を参照パターンマイクロウェルに20 μLを添加する。光から保護された(タンパク質に応じて)10〜20分間室温でインキュベートする(アルミ箔で皿を包む)。 インキュベーション後、18 μLのタンパク質溶液を取り出し、20μLのPBSで3回洗浄する。PBSの20 μLで参照パターンを作成するために使用されないマイクロウェルを保持します(図4D,Eを参照)。 最適なレーザーフォーカスの可視化と設定 エピ蛍光顕微鏡、20X目的および適切なソフトウェアを用いて参照パターンを可視化する(材料の表でこの研究で使用されるソフトウェアをチェックする)。参照パターンは、参照パターンが生成された周辺領域(例えば、上部ウェル領域)に表示される必要があります(図4Eを参照)。 カメラ パスを通じてパターン エッジにフォーカスを調整します。参照パターンに最適なフォーカスに従って Z 位置を記録します。この調整されたZ位置は、後続のパターニングに使用される最適なレーザーフォーカスになります。 5. ソフトウェアのセットアップとフォトパターニング 注:システムのキャリブレーションが達成されると(ステップ4)、ユーザーは、それぞれに1つまたは複数のタンパク質のパターンを生成するオプションを使用して、フォトパターニング用に必要なパターンテンプレート(テンプレート構成、図5)をアップロードします。マイクロウェル。マイクロパターニングプロセスには、フォトパターニングおよびタンパク質インキュベーションステップが含まれます(図2参照)。 無菌条件下で、すべてのマイクロウェルから18μLのPBSを取り出し、各マイクロウェルに5μLのPLPPを加えます。PLPPがマイクロウェルの全面に均質であることを確認します。 カルチャ皿を参照パターンマイクロウェル(図4D,E)を目標の上に配置し、レオナルドソフトウェアでパターンを選択します。 カメラパスを透過した光でマイクロウェルを視覚化し、ROIシンボルを選択します。ROIの直径を4,000 μmに設定し、デジタルROIのエッジを現在のマイクロウェルのエッジに重ね合います。[ロック]を選択します。注: ROI の形状と直径は、使用する PDMS ステンシルの設計とサイズによって異なります。たとえば、5,000 x 5,000 μm PDMS 二乗ステンシルを使用する場合は、5,000 x 5,000 μm 平方 ROI を使用します。 皿のマイクロウェルごとに重なり合うステップ(ステップ5.3)を繰り返します。完了後、透過光をオフにします。 参照パターン領域から離れた参照パターンマイクロウェルの中心に移動し、PRIMOを選択して、設計単位として ROI に投影される目的のパターン テンプレートをアップロードします (図 5参照)。パターンは、アクションと呼ばれるドロップダウン リストに表示され、ソフトウェアの[アクション] メニューに表示されます。注: パターン テンプレートは、テストの前に設計し、ソフトウェアにテンプレートをロードする前に 8 ビット Tiff ファイルとして保存する必要があります。 マイクロウェル全体にパターンを作成するには、設計ユニットを複製する必要があります。設計単位はマイクロウェル区域の約0.1 mm2をカバーする。[レプリケーション]メニューで、必要な列数と行数 (ソフトウェアの行)を設定します (図 5を参照)。 連続パターンを生成するには、列と線の間隔を調整します。本研究では、連続ストライプのパターンは、列間の-20 ~-35 μm 間隔(負の間隔)を使用して得られます。この負の間隔は、設計単位間の重複を作成します (図 5B,C)。 [複製]メニューでレーザー線量を設定します。この設定で最適なレーザー線量とPLL-PEGを使用すると、1390 mJ/mm2です。パターニング期間は[推定時間]パネルに表示されます。注:この場合、レーザーパワーは7.5 mW/mm2であり、1390 mJ/mm2の用量を使用して、各設計ユニットをパターン化するために約30sを取ります。たとえば、4 列と 4 行 (約 1.6 mm2)でレプリケートされた設計単位 (0.1 mm2)は、パターン化するのに 8 分かかります。培養皿表面がPEG-SVA(PLL-PEGと比較して約2倍のレーザー線量)でパッシベートされている場合は、より高いレーザー用量が必要な場合があります。 [ロック]を選択し、パターンが仮想的に表示されるまで待ちます。 パターンのパラメータを更新するには、関連するアクションをクリックし、パラメータのロックを解除して更新します。パターンの更新が完了したら、[もう一度ロック]を選択します。 同じマイクロウェル内の複数のタンパク質のパターニング(シーケンシャルマイクロパターニングラウンド)は、パターンの正確な位置合わせを必要とします。このようなアライメントを実現するには、必要なパターンテンプレートのすべてのセットを同時にアップロードします(第1および第2のフォトパターニングラウンドのパターン)。 パターン テンプレートの複製パラメータと線量パラメータを設定します。パラメータを設定すると、パターンは[アクション]リストにアクションとして表示されます。このテンプレート構成をソフトウェアのファイルとして保存します (図 5Dを参照)。 [アクション]リストで、最初のパターニング ラウンド中にパターン化する特定のアクションのみを選択し、2 番目のパターニング ラウンド中にパターン化されるアクションの選択を解除します (図 5Dを参照)。 ステップ 4.2 で参照パターンが生成された領域に移動します (たとえば、参照パターンマイクロウェルの上部領域は、図 4E を参照してください)。フォーカスを最適な Z 位置に調整します(ステップ 4.4 で取得)。注:使用されている顕微鏡に完璧なフォーカスシステムを選択することを強くお勧めします(可能な場合)。 パターニングを開始するには、再生シンボルを選択します。パターニング期間は[推定時間]パネルに表示されます。レオナルドソフトウェアバージョン4.4で、すべてのアクションがビジュアライゼーションメニューで青色に表示されると、パターニングが完了します。 6. タンパク質インキュベーション 注:マイクロウェルは、ECMタンパク質(好ましくは蛍光標識)でインキュベートされます。これらは、手順 5 で説明するフォト パターニング プロセスを通じて PEG が切り分けされた領域にのみバインドされます。各ウェルには4つのマイクロウェルを備えたPDMSステンシルが含まれており、各マイクロウェルで異なるタンパク質のインキュベーションなど、4つの異なる条件を同時にテストすることができます(図4D参照)。 マイクロパターンを視覚化するために、蛍光標識タンパク質(例えば、ラミニン、フィブロネクチン、またはフィブリノーゲンを赤色または緑色蛍光色素に結合)を使用して、マイクロパターンを視覚化します(ステップ6.7および9.4を参照)。あるいは、標識されていないタンパク質を吸着し、免疫蛍光を用いて後の段階で可視化することができる。注:ECMタンパク質(例えば、フィブロネクチン)は、既存のプロトコル33および市販の蛍光標識キット(すなわち、Alexa 488標識キット)を使用して標識することができ、または容易に標識(例えば、共役フィブリノゲン-488または)を購入することができます。ラミニンレッド蛍光ローダミン、材料の表を参照してください) 無菌条件下で、ECMタンパク質の所望の濃度(PBSで10μg/mLラミニン、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲン、材料の表およびステップ4.3を参照)を調記します。注:蛍光標識されたECMタンパク質は光に敏感であり、光(アルミ箔で皿をラップ)から保護する必要があり、常に氷の上に保管する必要があります。 無菌条件下で、マイクロウェルを20μLのPBSで3回洗浄し、PLPPを除去します。 すべてのマイクロウェルから18μLのPBSを取り出し、各マイクロウェルに20 μLのECMタンパク質溶液を加えます。室温で20〜30分間インキュベートし、光から保護します。注:最適なコーティングインキュベーション時間は、タンパク質の種類と濃度によって異なる場合があります。 インキュベーション後、ECMタンパク質溶液の15μLを取り出し、20μLのPBSでマイクロウェルを3回洗浄します。注:常に洗い出しの間に約5 μLのPBSを残してください。 たんぱく質を1つ(マイクロパターニングの1ラウンド)でパターニングする場合は、培養皿の貯蔵(ステップ10)または細胞めっき(ステップ11、図2参照)のいずれかに進みます。同じマイクロウェル内で異なるタンパク質を用いて第2ラウンドのマイクロパターニングを行う場合は、培養皿の貯蔵(ステップ10)または非特異的結合部位の遮断のいずれかに進む(ステップ7、図2を参照)。 オプションの品質管理ステップ:めっき細胞の前にエピ蛍光顕微鏡を使用して印刷パターンを視覚化し、画像化します。適切な蛍光チャネルを選択し、それに応じて露光時間を調整します。注:実験間のパターンの蛍光強度を比較するには、同じタンパク質に対して同じ露光時間を使用することが不可欠です。 7. 非特異的結合部位の遮断(複数のタンパク質パターンのみ) 注:同じマイクロウェル内の複数のタンパク質を用くマイクロパターニングには、順次パターニング工程が含まれます(図2参照)。ブロッキング剤(PLL-PEGまたはBSA)をマイクロウェルに添加してクロス結合を防ぎ、2番目のインキュベートされたタンパク質(ステップ9)が最初のインキュベートされたタンパク質(ステップ6)に結合する際に起こり、パターン内のタンパク質の混合物を回避します。 無菌条件下では、クロスバインディングを防ぐためのブロッキングステップとして、PLL-PEG(PBSでは0.1mg/mL)またはBSA(PBSでは1%BSA)を追加します。注:ブロッキング効率は、使用されるタンパク質の性質およびそれらの間の親和性によって異なる場合があります。PLL-PEG と BSA の両方をブロッキング剤として事前にテストすることをお勧めします (図 10D-I)。 ブロッキング剤を室温で1時間インキュベートし、光から保護します。ブロッキング剤の15 μLを取り外し、PBSの20 μLですべてのマイクロウェルを3回洗浄します。常に洗い出しの間に約5 μLのPBSを残します。 すべてのマイクロウェルから18μLのPBSを取り出し、各マイクロウェルに5μLのPLPPを加え、PLPPがマイクロウェルの全面に均質であることを保証します。 8. フォトパターニングの第2ラウンド(複数のタンパク質パターンのみ) 注:フォトパターニングとタンパク質インキュベーションの最初のラウンドの後、マイクロパターンが生成されます。フォトパターニングの第2ラウンドでは、2番目のタンパク質のパターンが同じマイクロウェルで生成されます(図2Cおよび図5Dを参照)。ソフトウェアで、このラウンド中にパターン化される正しいパターン テンプレート (アクション) を選択します (図 5Dを参照)。 最初のマイクロウェル(図4D)に移動します。デジタルROIとマイクロウェルの間に適切な重複を確認します。 以前に保存したテンプレート構成を読み込み(ステップ5.12)、2回目のフォトパターニングラウンド中にパターン化するアクションを選択します(最初のラウンドからアクションの選択を解除し、図5Dを参照)。 パターニングを開始するには、再生シンボルを選択します。ソフトウェアでレーザーがオンであることを確認します。 9. タンパク質インキュベーションの第2ラウンド(複数のタンパク質パターンのみ) 注:プロトコルのこの部分では、蛍光標識タンパク質/sは、フォトパターニングの第2ラウンドの後に培養皿上でインキュベートされます。 無菌条件下で、PBSの20 μLでマイクロウェルを3回洗浄し、PLPPを除去します。18 μL の PBS を取り出し、各マイクロウェルに 20 μL の ECM タンパク質溶液を追加します。室温で20~30分間インキュベートし、光から保護します。注:最適なコーティングインキュベーション時間は、タンパク質の種類と濃度によって異なる場合があります。 インキュベーション後、ECMタンパク質溶液の15μLを取り出し、20μLのPBSでマイクロウェルを3回洗浄します。常に洗い出しの間に約5 μLのPBSを残します。 培養皿の貯蔵(ステップ10)または細胞めっき(ステップ11、図2参照)のいずれかに進みます。 オプションの品質管理ステップ:エピ蛍光顕微鏡を使用して、めっき細胞の前に印刷パターンを視覚化し、画像化します。適切な蛍光チャネルを選択し、露光時間を調整します。注:実験間のパターンの蛍光強度を比較するには、同じタンパク質に対して同じ露光時間を使用することが不可欠です。 10. マイクロパターンの保存 注:吸着タンパク質を含むマイクロパターンは、プロトコルの異なるステップ中に保存することができます(図2参照)。複数のタンパク質を用いたマイクロパターニングの場合、マイクロパターンは、マイクロパターニングの最初のラウンドの後、またはマイクロパターニングの2つの順次ラウンドが完了した後に保存することができます(図2B参照)。 PLL-PEGでパッシベートした場合は、マイクロパターンをPBS(ウェル当たり3mL)で最大3日間4°Cに保存します。 培養皿をPEG-SVAでパッシブした場合、マイクロパターンを最大1ヶ月間保存できます。そのために、二重蒸留脱イオン水で集中的にマイクロパターンをすすいで、アルゴンまたは窒素の無菌エアガンで乾燥させますが、通常の空気も使用できます。乾燥後、マイクロパターンは最大1ヶ月間4°Cで保存できます(PRIMOシステムサポートチーム、パーソナルコミュニケーション)。 11. めっき細胞 注:次のステップの間に、細胞は、調製されたマイクロパターン培養皿/esにめっきされます。これらの研究では、ニューロン細胞株(CAD細胞)が31を使用する。しかし、このプロトコルは、他の細胞タイプの目的を研究するように調整することができる(必要に応じて細胞めっきプロトコルを調整する)。 分化培地を用いて48時間のCAD細胞を分化する(DMEMは1%グルタミンを補充し、血清なしで、1%のペン/ストレップで、材料の表を参照)。 内側ガラスに細胞を含む培地のプレート1 mLを、すべてのマイクロウェルを覆い、培養皿を37°C、5%CO2インキュベーターに入れます。