Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Hung  D. Nguyen; Phung Thanh Huong; Krystal Hossack; Sanjeev Gurshaney; Kevin Ezhakunnel; Thien-Huong Huynh; Anamaria Morales Alvarez; Nhat-Tu Le; Hung  N. Luu

doi:10.3791/60083

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Published: March 17, 2020

doi:

10.3791/60083

Hung D. Nguyen*¹, Phung Thanh Huong*², Krystal Hossack¹, Sanjeev Gurshaney¹, Kevin Ezhakunnel¹, Thien-Huong Huynh¹, Anamaria Morales Alvarez¹, Nhat-Tu Le³, Hung N. Luu^4,5

¹Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences,University of Central Florida, ²Department of Biochemistry,Hanoi University of Pharmacy, ³Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences,Houston Methodist Research Institute, ⁴Department of Epidemiology,University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, ⁵Division of Cancer Control and Population Sciences,University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

Özet

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Abstract

Allojeneik kemik iliği transplantasyonu (KNOT), tümörlerin kökünü kurutmak için greft-versus-lösemi (GVL) etkisine bağlı hematolojik maligniteler için etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, uygulama greft-versus-host hastalığı gelişimi ile sınırlıdır (GVHD), BMT önemli bir komplikasyon. GVHD donör greftlerinde T-hücreleri alıcı hücreler tarafından ifade alloantijen tanımak ve alıcı sağlıklı dokulara karşı istenmeyen immünolojik saldırılar monte uyarılır. Böylece, geleneksel tedaviler donör T-hücre alloreactivity bastırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bu yaklaşımlar gvl etkisini önemli ölçüde bozar, böylece alıcının hayatta kalması iyileştirilmez. Terapötik yaklaşımların BMT, GVL ve GVHD üzerindeki etkilerini anlamak bu nedenle önemlidir. Donör T-hücrelerini uyarmak için antijen sunum ve sitokin salgılayıcı kapasiteleri nedeniyle, alıcı dendritik hücreler (DCs) GVHD indüksiyonönemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, alıcı DC’leri hedefleme gvhd kontrol etmek için potansiyel bir yaklaşım haline gelir. Bu çalışma, ev sahibi DC’lerin transplantasyon sonrası GVH ve GVL yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için yeni bir BMT platformunun açıklamasını sağlar. Ayrıca transplantasyon sonrası GVHD ve GVL biyolojisini incelemek için etkili bir BMT modeli sunulmaktadır.

Introduction

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (KT) hematolojik malignitelerin tedavisinde etkili bir tedavidir¹^,² greft-versus-lösemi (GVL) etkisi ile³. Ancak, donör lenfositler her zaman alıcı dokulara karşı istenmeyen immünolojik ataklar monte, greft-versus-host hastalığı olarak adlandırılan bir süreç (GVHD)⁴.

GVHD Murine modelleri GVHD ve GVL^yanıtı5 biyolojisini incelemek için etkili bir araçtır. Fareler uygun maliyetli bir araştırma hayvan modelidir. Onlar küçük ve verimli moleküller ve biyolojik geliştirmeⁿⁱⁿerken aşamalarında ile dosed 6 . Onlar genetik olarak iyi tanımlanmış, çünkü fareler genetik manipülasyon çalışmaları için ideal araştırma hayvanlar, hangi biyolojik yollar ve mekanizmaları incelemek için idealdir⁶. C57BL/6 (H2^b) ile BALB/c (H2^d)ve FVB (H2^q)→C57BL/6 (H2^b)⁵^,⁷gibi birkaç fare majör histouyumluluk kompleksi (MHC) MHC uyumsuzmodelleri iyi kurulmuştur. Bunlar, bireysel hücre tiplerinin, genlerin ve GVHD’yi etkileyen faktörlerin rolünü belirlemek için özellikle değerli modellerdir. C57/BL/6 (H2^b)ebeveyn donörlerinden MHC I (B6.C-H2^bm1)ve/veya MHC II (B6.C-H2b^m12)mutasyonu olan alıcılara yapılan transplantasyon, hem MHC sınıf I’de hem de sınıf II’de bir uyumsuzluk olduğunu ortaya koymuştur. Bu hem CD4⁺ ve CD8⁺ T-hücreleri hastalık gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir⁷^,⁸. GVHD aynı zamanda ‘pro-inflamatuar sitokin fırtınası’ olarak bilinen inflamatuar bir kaskad yer almaktadır⁹. Murine modellerinde en sık kullanılan klima yöntemi x-ray veya ¹³⁷Cs ile toplam vücut ışınlaması (TBI) yöntemidir. Bu alıcının kemik iliği ablasyon yol açar, böylece donör kök hücre engraftment izin ve greft reddini önlemek. Bu donör hücrelere yanıt olarak alıcı T-hücrelerinin çoğalmasını sınırlayarak yapılır. Ayrıca, genetik eşitsizlikler de küçük MHC-uyumsuzluk¹⁰bağlıdır hastalık indüksiyon, önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, miyeloablatif ışınlama dozu farklı fare suşlarında değişir (örneğin, BALB/c→C57BL/6).

Donör T-hücrelerinin konak antijen sunan hücreler (AAP’ ler) tarafından aktivasyonu GVHD gelişimi için gereklidir. ADC’ler arasında, dendritik hücreler (DCs) en güçlü. Onlar kalıtsal onların üstün antijen alımı nedeniyle GVHD indükleme yeteneğine sahiptirler, T-hücre ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu, ve patojenik subsets içine T-hücreleri polarize pro-inflamatuar sitokinler üretimi. Alıcı DCs transplantasyon sonrası T-hücre astar ve GVHD indüksiyon kolaylaştırmak için kritik¹¹^,¹². Buna göre, DCs GVHD tedavisinde ilginç hedefler haline gelmiştir¹².

TBI donör hücre engraftment geliştirmek için gereklidir. TBI etkisi nedeniyle alıcı CD’ler aktive edilir ve transplantasyondan sonra kısa bir süre hayatta^kalır12. Biyolüminesans veya floresan kullanımındaki büyük gelişmelere rağmen, GVHD’de alıcı DC’lerin rolünü incelemek için etkili bir model oluşturmak hala zordur.

Donör T-hücreleri GVL aktivitesi için itici güç olduğundan, t-hücre alloreactivity bastırmak için steroid gibi immünsupresif ilaçlar kullanarak tedavi stratejileri genellikle tümör nüks veya^{enfeksiyonneden 13}. Bu nedenle, alıcı DC’leri hedeflemek GVL etkisini korurken ve enfeksiyondan kaçınırken GVHD tedavisinde alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.

Kısacası, mevcut çalışma, alıcı DC’lerde farklı sinyal türlerinin GVHD gelişimini ve BMT’den sonra GVL etkisini nasıl düzenlediğini anlamak için bir platform sağlamaktadır.

Protocol

Deneysel prosedürler, Central Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. 1. GVHD İndüksiyon NOT: Allojeneik kemik iliği (BM) hücre nakli (adım 1.2) ışınlama dan sonra 24 saat içinde yapılır. Aşağıda açıklanan tüm işlemler steril bir ortamda gerçekleştirilir. Bir doku kültürü başlık prosedürü gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın. 0. Gün: Alıcı fareleri hazırlay…

Representative Results

Majör MHC uyumsuz B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir (Şekil 2). Cooke ve ark.16 tarafından daha önce tespit edilen altı GVHD klinik bulgunun tümü WT-B6 T-hücreleri ile nakledilen alıcılarda meydana gelmekte, ancak gvhd-negatif grubunu temsil eden BM ile nakledilen alıcılarda (adım 1.5) yer almıyordu. Bu modelde GVHD gelişiminde i…

Discussion

Belirli bir kişiye uygun kök hücre kullanımı gelişmiş ve dirençli kanserlerin tedavisinde etkili bir yaklaşımdır¹⁸. Küçük molekül ilaç, ancak, uzun kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin birincil odak kalmıştır. Öte yandan, hücresel tedavide donör ve konak arasındaki etkileşimlerin çok sayıda kararlı tedavi sonuçlarını etkileyebilir, BMT sonra GVHD gelişimi gibi^1.

BmT’nin MHC’li büyük fare modelleri GVHD’nin biy…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma University of Central Florida College of Medicine start-up hibe (HN), Pittsburgh Üniversitesi Tıp Merkezi Hillman Kanser Merkezi start-up hibe (HL), Amerika Birleşik Devletleri NIH Grant #1P20CA210300-01 ve Vietnam Sağlık Bakanlığı Hibe #4694/QD-BYT (PTH için) tarafından desteklenir. Güney Carolina Tıp Üniversitesi’nden Dr. Xue-zhong Yu’ya çalışma için malzeme sağladığı için teşekkür ederiz.

Materials

0.5 M EDTA pH 8.0 100ML	Fisher Scientific	BP2482100	MACS buffer
10X PBS	Fisher Scientific	BP3994	MACS buffer
A20 B-cell lymphoma	University of Central Florida	In house	GVL experiment
ACC1 fl/fl	Jackson Lab	30954	GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre	University of Central Florida		GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485	T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientific	13-0452-85	T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC	Thermo Fisher Scientific	10452-85	Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700	Thermo Fisher Scientific	117319	Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-82	Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin	Thermo Fisher Scientific	13-0041-86	T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement)	Thermo Fisher Scientific	48-0042-82	Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE	Thermo Fisher Scientific	12-0900-83	Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC	Thermo Fisher Scientific	17-0081-83	Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5958-82	Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC	Thermo Fisher Scientific	17-5320-82	Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin	Thermo Fisher Scientific	13-5921-85	T-cell enrichment
Anti-Thy1.2	Bio Excel	BE0066	BM generation
B6 fB^-/- mice	University of Central Florida	In house	Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1⁺) mice	Charles River	564	Donors
BALB/c mice	Charles River	028	Transplant recipients
C57BL/6 mice	Charles River	027	Donors/Recipients
CD11b	Thermo Fisher Scientific	13-0112-85	T-cell enrichment
CD25-biotin	Thermo Fisher Scientific	13-0251-82	T-cell enrichment
CD45R	Thermo Fisher Scientific	13-0452-82	T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin	Thermo Fisher Scientific	13-5971-82	T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM	Thermo Fisher Scientific	22363547	Cell preparation
Cell strainer 70 uM	Thermo Fisher Scientific	22363548	Cell preparation
D-Luciferin	Goldbio	LUCK-1G	Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Bilogicals R&D system	D17051	Cell Culture
Flow cytometry tubes	Fisher Scientific	352008	Flow cytometry analysis
FVB/NCrl	Charles River	207	Donors
Lipopolysacharide (LPS)	Millipore Sigma	L4391-1MG	DC mature
LS column	Mitenyi Biotec	130-042-401	Cell preparation
MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302	T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R	Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140	Media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	Media
TER119	Thermo Fisher Scientific	13-5921-82	T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200	Perkin Elmer	Xenogen IVIS-200	Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator	Precision X-RAY	X-RAD 320	Total Body Irradiation

Referanslar

Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Etiketler

Bone Marrow Transplantation Dendritic Cells Graft-versus-host Disease T-cell Depletion Cell Isolation Cell Culture Immune Cell Populations Macrophages Neutrophils Cell Regeneration Bone Marrow Preparation Cell Harvesting Cell Straining Cell Washing Cell Resuspension Cell Incubation Cell Counting Cell Pooling

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T., Alvarez, A. M., Le, N., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).