Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Bernard  C. Lo; Samuel  B. Shin; Melina Messing; Kelly M. McNagny

doi:10.3791/60068

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Published: September 22, 2019

doi:

10.3791/60068

Bernard C. Lo¹, Samuel B. Shin¹, Melina Messing¹, Kelly M. McNagny¹

¹The Biomedical Research Centre,University of British Columbia

Özet

Bu protokol, transmural inflamasyon ve fibrozis de dahil olmak üzere Crohn hastalığının önemli patolojik işaretleri benzer Salmonella tahrikli bağırsak fibrozis bir fare modeli açıklar. Bu yöntem, C57Bl/6 genetik arka planda tutulan mutant fareler kullanılarak fibrotik sonuçları değiştiren konak faktörlerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir.

Abstract

Kollajen gibi ekstrasellüler matriksin patolojik birikimi ile karakterize doku fibrozisi kalıcı inflamasyon ve disregulated onarım Sonucudur. İnflamatuar barsak hastalığında (İBH) fibrozis, cerrahi rezeksiyon dışında etkili bir tedavi nin olmadığı tekrarlayan darlık oluşumlarına yol açar. Geç başlangıcı nedeniyle, fibrozis sürücü süreçleri daha az çalışılır ve büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu nedenle, fibrotik komplikasyonlar IBD önemli bir sorun temsil eder. Bu protokolde, streptomisin in vivo modeli nde C57Bl/6 farelerinin streptomisin ön tedavisi ve ardından aşı sınıfı Salmonella Typhimurium ΔAroA mutantmutantının kalıcı patojen kolonizasyonuna yol açtığı ve çekum fibrozis. S. hazırlanması için metodolojiler. Timülasyon için Tiphimurium ΔAroA, çekum ve dalaktaki patojen yüklerinin ölçülmesi ve bağırsak dokularında kollajen birikiminin değerlendirilmesi açıklanmıştır. Bu deneysel hastalık modeli ya geliştirmek veya CD benzeri bağırsak fibrozis iliklerine ev sahibi faktörleri incelemek için yararlıdır.

Introduction

Ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD) IBD’nin iki ana formudur ve gastrointestinal sistem ^1,²kronik ve nüks eden inflamatuar bozukluklar olarak karakterizedir. Bu bozukluklar hastaların yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. IBD belirtileri karın ağrısı dahil, ishal, mide bulantısı, kilo kaybı, ateş, ve yorgunluk³. Son çalışmalar, hastalık patogenezine katkıda bulunan genetik ve çevresel faktörleri belirlemiş; bu tür risk faktörlerinin, luminal antijenlerin translokasyonu veya aşırı örneklemesi ile sonuçlanan epitelyal bariyerin bozulmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir^4. Sonuç olarak, bu bağırsak bağışıklık hücreleri tarafından aracılık kommensal floraya bir anormal inflamatuar yanıt başlatır⁴. IBD ile ilişkili komplikasyonların özellikleri eklemler, cilt ve karaciğer 1 dahil olmak üzere çeşitli organları etkileyen GI yolu ötesinde sitelere kadar uzanabilir¹^,². UC işaretleri genellikle kolon¹lokalize şiddetli ve diffüz inflamasyon içerir. Hastalık patolojisi, yüzeyel mukozal ülserasyonlarla sonuçlanan barsak mukozasını ve submukozasını etkiler^1. Buna karşılık, CD hastalığın kanıtı yaygın kolon ve distal ileum bulunur rağmen GI yolu herhangi bir bölümünü etkileyebilir². Ayrıca, CD iltihabı transmural, bağırsak duvarının tüm katmanları etkileyen².

Tespit edilmiştir çeşitli IBD duyarlılık genleri epitel bariyer veya bağışıklık disregülasyonu hastalığın ilerlemesi için kritik katkıda olduğunu gösterir⁵. Monositler tarafından ifade edilen nükleotid oligomerizasyon etki 2 (NOD2) mutasyonlarının CD’ye karşı artan duyarlılıkla ilişkili olduğu bulunmuştur; bu bakteriyel bileşenlerin değiştirilmiş doğuştan gelen bağışıklık tespiti ve hastalık arasında bir bağlantı vurgulamaktadır⁶. Daha yeni genom çapında ilişki çalışmaları (GWAS) genetik varyasyonlar da dahil olmak üzere IBD patogenezinde potansiyel olarak dahil ek yollar ortaya koymuştur: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R bağımlı yollar adaptif bağışıklık bağlı, MUC1, MUC19, ve PTGER4 bağırsak bariyer bakım, ve ATG16Laracılı otofaji⁷^,⁸^,⁹. Bu popülasyon tabanlı genetik çalışmalar IBD anlayışımızı geliştirmiş olsa da, duyarlılık alelleri tek başına kronik hastalığın başlatılması ve sürdürülmesinde yetersizdir³. Bağırsak mikrobiyom bileşiminde değişiklikler ve çeşitliliğin azalması da dahil olmak üzere diğer genetik olmayan faktörler bağırsak iltihabı ile ilişkili olmuştur. Ancak, bağırsak disbiyoz öncesinde veya disregulated immün yanıtların sonucu olup olmadığı belirsizdir³. IBD etiyolojisi belirsiz liğini korusa da, hastalığın patogenezini anlamamız bağırsak iltihabının deneysel fare modelleri ile geliştirilmiştir¹⁰^,¹¹. Bu modeller tek tek tam olarak insan hastalığının karmaşıklığını temsil etmez, ancak IBD ile ilgili olabilir patofizyolojik yolları açıklamak ve geçici terapötik stratejilerin doğrulanması için^değerli10^, ^{11. Yıl.} Bu tür fare modelleri genellikle kimyasal indüksiyon veya enfeksiyon, bağışıklık hücresi transferi veya genetik manipülasyon tarafından inflamasyon başlatılması güveniyor. Ayrıca, bu stratejiler genellikle epitelyal bütünlük veya doğuştan gelen veya adaptif bağışıklık modülasyonu tedirginlik içerir.

Salmonella enterica serovars insanlar ve fareler enfekte edebilir bağırsak patojenleri vardır. Yutma sonra, Salmonella epitel doğrudan invazyonu ile bağırsak kolonize olabilir, M hücreleri, veya antijen hücreleri sunan¹². S ile sözlü enfekte fareler. Typhimurium, GI sisteminde nispeten düşük bolluğu olan dalak ve mezenterik lenf düğümleri gibi sistemik bölgelerin öncelikle kolonizasyonuile sonuçlanır¹². Ancak, streptomisin ile farelerin ön işlem normal mikrobiyota konak koruyucu etkilerini azaltarak bağırsak Salmonella kolonizasyonu verimliliğini artırır¹³. Bu modelin patolojik özellikleri epitelyal bariyer bozulması veya ülserasyonu dahil, granülosit alımı, ve şiddetli ödem¹³. Alternatif olarak, aşı sınıf S ile enfeksiyon. Typhimurium ΔAroA mutant enfeksiyon¹⁴sonra gün 40 kadar devam çekum ve kolon kronik kolonizasyon yol açar. S. Typhimurium ΔAroA suşu aromatik amino asitlerin biyosentezinde bir kusura sahiptir; Bu mutant suşu avirulent hale getirir ve son derece etkili bir aşı olarak kullanılabilir¹⁵. Farelerde oral enfeksiyon th1 yol açar- ve Th17-sitokin ilişkili inflamatuar yanıt, geniş doku remodeling, ve kollajen birikimi. Doku patolojisi TGF-β1, CTGF ve IGF¹⁴gibi pro-fibrotik faktörün yüksek düzeyleri ile ilişkilidir. Bu modelde bildirilen transmural fibrotik skar, IBD’de sıklıkla gözlenen darlık oluşumlarını anımsatır. Salmonella tarafından fibrozis indüksiyonu Salmonella patojenite adaları (SPI)-1 ve 2 ¹²tarafından kodlanmış virülans gerektirir. Daha da önemlisi, bu S. Tymphimurium ΔAroA enfeksiyon modeli, C57/Bl6 arka planda tutulan mutant farelerde fibrotik yanıtların incelenmesi için yararlı bir sistemdir. C57/Bl6 suşu S’e karşı son derece hassastır. Tifiumurim SL1344 enfeksiyonu nedeniyle doğal direnç ilişkili makrofaj proteinini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonu (NRAMP)-1¹⁶^,¹⁷. Bu model de IL-17A ve RORα bağımlı doğuştan lenfoid hücrelerin patogeneziiçin önemli katkılar olduğunu bulduk¹⁸.

CD önemli bir komplikasyon kollajen²de dahil olmak üzere ekstrasellüler matriks (ECM) disregulated ve aşırı birikimi 2^,¹⁹. GI yolu rejenerasyon için nispeten yüksek bir kapasiteye sahip olmasına rağmen, fibrotik skar kronik ve şiddetli inflamasyon ile ilişkili çözülmemiş yara iyileşme yanıtları nedeniyle ortaya çıkabilir²⁰^,²¹. CD’de, bu önemli organ bozukluğu^21,²²yol doku mimarisi üzerinde zararlı etkileri ile sonuçlanır. CD gözlenen iltihabın transmural doğası sonuçta semptomatik darlık veya darlık oluşumu ile ilişkili bağırsak duvarının kalınlaşma öncesinde²¹. CD hastalarının yaklaşık üçte biri bu komplikasyon için intestinal rezeksiyon gerektirir²². Azatioprine veya anti-TNFα biyolojik olarak immünsupresan kullanımının hiçbir etkisi olmadığı veya sadece mütevazı bir şekilde cerrahi müdahale gereksinimini azalttığı göz önüne alındığında IBD’de etkili bir anti-fibrotik tedavi yoktur¹⁹^,²³. Fibrozis kronik inflamasyon sonucu olduğu düşünülmektedir iken, fibroblastlar ve perisitler gibi mezenkimal kökenli hücreler fibrotik skar ECM birincil hücresel kaynakları olduğu düşünülmektedir²¹^,²⁴. Kronik S. Typhimurium ΔAroA enfeksiyonu CD benzeri özelliklerin patogenezi hakkında bilgi sunabilir bağırsak fibrozis sağlam bir fare modelidir.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. 1. Salmonella Typhimurium ΔAroA kültürlerinin farelerin oral gavajı için hazırlanması Dondurulmuş gliserol stoğundan. Typhimurium ΔAroA, steril aşılama halkası ile 100 μg/mL streptomisin içeren LB agar kullanarak bir çizgi plaka hazırlayın. Bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Çizgi plakaları 4 °C’de bir haftaya kadar saklanabilir. …

Representative Results

Streptomisin tedavisi nin ardından S. ile oral enfeksiyon Typhimurium ΔAroA özellikle çekumda sağlam bağırsak iltihabı ve fibrozise yol açar (Şekil 1). Tipik patojen yükleri 1 g çekum başına 108 ila 109 CFU ve 1 g dalak başına 104 CFU enfekte hayvanlardan kurtarılabilir(Şekil 2). Pikrosirius kırmızı lekeli çekal kesitlerinde fibrozisin değerlendirilmesi enfeksiyondan 21 gün sonra pik fibrozisi gö…

Discussion

IBD patogenezini anlamamız, bağırsak iltihabının fare modelleri ile büyük ölçüde geliştirilmiştir. Bu tür bireysel modeller karmaşık ve multifaktöriyel insan hastalığının tüm özelliklerini özetlemese de, hastalığın ilerlemesinin temel özelliklerini belirlemede yararlı olmuştur. Mevcut tedaviler hastalık gelişimini tersine çevirmede etkisiz olduğundan, IBD ile ilişkili fibrotik darlıklar karşılanmamış önemli bir klinik ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Ayrıca, bağırsak fibrozisme…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingrid Barta’ya histoloji hizmetleri için teşekkür ederiz.

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM

Referanslar

Danese, S., Fiocchi, C. Ulcerative colitis. New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).
Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome. Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).
Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).
Ogura, Y., et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn’s disease. Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).
Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
Rivas, M. A., et al. Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease. Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).
Rioux, J. D., et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).
Uhlig, H. H., Powrie, F. Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease. European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).
Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
Grassl, G. A., Finlay, B. B. Pathogenesis of enteric Salmonella infections. Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).
Barthel, M., et al. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance. Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).
Valdez, Y., et al. Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice. Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).
Lo, B. C., et al. The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn’s disease. Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).
Burke, J. P., et al. Fibrogenesis in Crohn’s disease. American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).
Hogan, B. L., et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).
Fiocchi, C., Lund, P. K. Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).
Rieder, F., Fiocchi, C. Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).
Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. Surgery for adult Crohn’s disease: what is the actual risk?. Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).
Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).
Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
Lo, B. C., et al. IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection. Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).
Fichtner-Feigl, S., et al. Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis. Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).
Fichtner-Feigl, S., et al. IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis. Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).
Johnson, L. A., et al. Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a "Top-Down" approach to intestinal fibrosis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).
Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. Persistent infection with Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis. Nature Communications. 4, 1957 (2013).
Imai, J., et al. Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. , (2019).

Etiketler

Intestinal Fibrosis Chronic Inflammation Crohn’s Disease Salmonella Infection Mouse Model Oral Gavage Streptomycin LB Agar LB Broth Bacterial Culture Sterile Technique

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Lo, B. C., Shin, S. B., Messing, M., McNagny, K. M. Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e60068, doi:10.3791/60068 (2019).