Электропорация Метод для In Vivo Доставка плазмидной ДНК в взрослых зебрафиш теленефалион

Зебрафиш являются отличными моделями животных для изучения регенерации мозга после травмы раны. По сравнению с млекопитающими, на эволюционной лестнице, менее развитые виды, такие как зебра, как правило, показывают более высокие показатели составного нейрогенеза и более широкие области взрослого нейронных стволовых клеток жительства, что приводит к постоянному генерации новых нейронов во всем большинство областей мозга во взрослой жизни. Эта особенность, как представляется, коррелируют со значительно более высокой регенеративной способности зебры по сравнению с млекопитающими¹, как зебрацы имеют замечательный потенциал для эффективного создания новых нейронов в большинстве моделей травмы мозга изучены^{2, 3,4,5,6,7,8}. Здесь изучается теленцефалон зебры, так как это область мозга с выдающимся нейрогенезом во взрослом возрасте. Эти зоны взрослого нейрогенеза гомологичны к нейрогенным зонам в взрослом мозге млекопитающих^9,10,11.

Обильные нейрогенные области в теленефалион зебрафиш присутствуют из-за существования радиальной глии, как клетки или клетки эпиндимолии. Эпендимоглиальные клетки действуют как резиденты взрослых нервных стволовых клеток и несут ответственность за генерацию новых нейронов как в нетронутой и регенерирующей мозга^3,5. Эксперименты по отслеживанию линии показали, что желудочковая эпендимолия реагирует на травмы, затем размножается и генерирует новые нейробласты, которые мигрируют на место поражения^5. Из-за вечной природы теленефалиона зебры, эпендимолиальные клетки выстраиваются в линию поверхности желудочка и строят стенку желудочков. Стенка желудочковых суставов образуется слоем эпидимальных клеток(рисунок 1A). Важно отметить, что зебрафиш ependymoglia воплощают характеристики как млекопитающих радиальной глии и эпендимальных клеток. Длинные радиальные процессы являются типичной особенностью клеток радиальной глии, в то время как клеточные расширения и плотные соединения (а также их желудочковые положения) являются типичными особенностями эпендимальных клеток^12,13,14. Таким образом, эти клетки называются эпедимолийными клетками.

Чтобы следить за поведением in vivo одиночных эпедимолиальных клеток во время регенерации, они должны быть надежно помечены. Различные методы in vivo маркировки клеток для флуоресцентной микроскопии были ранее описаны, такие как эндогенные репортеры или липофильные красители¹⁵. Эти методы, в отличие от электропорации, могут потребовать более длительных периодов времени и часто не дают возможности маркировки одной клетки или постоянного долгосрочного отслеживания. Электропорация, однако (кроме одноклеточной маркировки), предлагает возможность введения новой ДНК в клетку-хозяина. Кроме того, по сравнению с другими методами передачи ДНК в клетки, электропорация была продемонстрирована как один из самых эффективных методов^16,17,18,19.

Представлен протокол электропорации, который был усовершенствован с целью маркировки отдельных эпеничных клеток во взрослом теленефалии зебры. Этот протокол позволяет маркировки одного эпенимолитальных клеток для того, чтобы следовать за ними в течение длительного периода²⁰ или манипулировать конкретными путями в клеточной автономной манере^21,22.