Purification de l'homme S100A12 et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation cellulaire immunitaire

S100A12 est une protéine de liaison de calcium qui est principalement produite par les granulocytes humains. La protéine est surexprimée pendant l’inflammation (systémique) et ses niveaux de sérum, particulièrement dans les maladies (auto)inflammatoires telles que l’arthrite idiopathique juvénile systémique (sJIA), la fièvre méditerranéenne familiale (FMF) ou la maladie de Kawasaki (KD) peut informer au sujet de l’activité de la maladie et la réponse à la thérapie. Selon les récepteurs de reconnaissance des modèles (PRR) tels que les récepteurs à péage (TLR), le système immunitaire inné peut être activé par des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) comme les lipopolysaccharides (LPS) ou des modèles moléculaires associés à des dommages (DAMP; également appelé «alarmins»). Les DAMP sont des molécules endogènes telles que les protéines cellulaires, les lipides ou les acides nucléiques¹. DAMP-fonctions sont bien décrits pour les membres de la famille des protéines calgranuline, S100A8/A9 et S100A12², qui sont également signalés pour fonctionner comme métal divalent ion-chelating peptides antimicrobiens^{3,4, 5,6}. Selon la force d’ion disponible S100A12 peut, comme d’autres membres de la famille S100, organiser dans différents homomultimers et jusqu’à récemment l’impact de S100A12-oligomerisation sur PRR-interaction, en particulier TLR4, était inconnu.

La forme monomérique de la protéine (92 acides aminés, 10,2 kDa) se compose de deux structures d’hélice-boucle-boucle EF reliées par un lien flexible. Le C-terminalEF-hand contient le motif classique Ca^{2 –}contraignant tandis que le N-terminalEF-hand présente une structure de boucle étendue spécifique aux protéines S100 (‘pseudo-EF-hand’) et révèle une affinité Ca^2′. La liaison Ca^2MDpar S100A12 peut entraîner un changement conformationnel majeur dans le terminus Cdes protéines, qui entraîne l’exposition d’un patch hydrophobe sur chaque monomère et forme l’interface de dimerisation. Ainsi, dans des conditions physiologiques, la plus petite structure quaternaire formée par S100A12 est un dimère non covalent (environ 21 kDa) dans lequel les monomères individuels sont en orientation antiparallèle. Lorsqu’il est disposé comme dimère, S100A12 est signalé à séquestreZ2 ainsi que d’autres ions métalliques divalents, par exemple, Cu^{2 avec} une forte affinité⁷. Ces ions sont coordonnés à l’interface dimère S100A12 par les acides aminés H15 et D25 d’une sous-unité et H85 ainsi que H89 de l’autre sous-unité anti-parallèle^8,9,10. Tandis que des études antérieures suggèrent que Zn^{2 -chargé}S100A12 peut induire l’organisation de la protéine en homo-tetramers (44 kDa) et pour avoir comme conséquence l’augmentation De Ca²– affinité^11,12, titration métallique récente les études⁶ suggèrent Ca²-contraignant par S100A12 pour augmenter l’affinité de la protéine à Zn². Une fois que les mains EF S100A12 sont entièrement occupées par Ca^2,on pense que le Ca^{2 supplémentaire} se lie entre les dimères, déclenchant la formation d’hexamer (environ 63 kDa). L’architecture de la structure hexameric quarternary est clairement différente de celle du tétramer. Il est proposé que l’interface tétramer est perturbée pour donner lieu à de nouvelles interfaces dimer-dimer qui bénéficie formation hexamer¹⁰. S100A12 est presque exclusivement exprimé par les granulocytes humains où il constitue environ 5% de toute la protéine cytosolique¹³. Dans sa fonction DAMP S100A12 a été historiquement décrit comme agoniste du récepteur multi-ligand pour les produits finaux avancés de glycation (RAGE), alors appelé protéine extracellulaire nouvellement identifiée rage-contraignante (EN-RAGE)¹⁴. Bien que nous ayons précédemment rapporté biochimique S100A12-contraignant à la fois RAGE et TLR4¹⁵, nous avons récemment démontré monocytes humains pour répondre à la stimulation S100A12 d’une manière TLR4-dépendante¹⁶. Cela nécessite l’arrangement de S100A12 dans sa ca²/Zn^{2 -induit}structure hexameric quarternary¹⁶.

Ici nous décrivons une procédure de purification pour l’homme recombinant S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des stimulations de cellules immunitaires^16,17. Ceci est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend initialement une colonne d’échange d’anions pour isoler et concentrer la protéine et éliminer les contaminations en vrac (par exemple, les endotoxines/lipopolysaccharides)¹⁸. Les résines de chromatographie ion-échange séparent les protéines sur la base de différentes charges de surface nettes. Pour les protéines acides comme S100A12 (point isoélectrique de 5,81), un système tampon avec un pH de 8,5 et une forte résine d’échange d’anion conduit à une bonne séparation. Les protéines liées ont été élucées avec un gradient tampon à haute teneur en sel. Avec une augmentation de la force ionique des ions négatifs dans le tampon d’élution concurrencent les protéines pour les charges sur la surface de la résine. Les protéines s’éliment individuellement en fonction de leur charge nette et, par conséquent, les tampons décrits ci-dessus permettent d’isoler et de concentrer la protéine S100A12 surexprimée. En raison de groupes chargés négativement dans les lipopolysaccharides, ces molécules se lient également aux résines d’échange d’anion. Cependant, leur charge nette plus élevée entraîne une élution ultérieure dans le gradient de haute teneur en sel appliqué. La deuxième étape de la procédure de purification a été introduite à des fins de polissage. Cela permet d’utiliser la capacité de liaison de calcium de S100A12 et élimine les impuretés restantes sur une colonne hydrophobe-interaction. La liaison calcique de S100A12 entraîne un changement conformationnel et une exposition de plaques hydrophobes à la surface de la protéine. À cette condition, S100A12 interagit avec la surface hydrophobe de la résine. Sur le calcium-chelating par EDTA, cette interaction est inversée. En présence d’ions, en particulier de calcium et de zinc, S100A12 s’arrange en oligomères homoméricagris. Pour étudier les relations structure-fonction des différents oligomères, nous avons stabilisé le sadicycle, le tétramérique et le recombinant hexamérique S100A12 avec un crosslinker chimique et avons séparé les complexes sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille. Enfin, pour analyser la fonctionnalité et l’activité biologique de la protéine purifiée et de ses oligomères induits par les ions, la libération de cytokine du monocyte stimulé S100A12 et du LPS peut être comparée.

Diverses méthodes de purification du S100A12 ont été décrites jusqu’à présent. Jackson et coll.¹⁹, par exemple, ont publié un protocole avec purification par l’intermédiaire d’une colonne d’échange d’anion et d’une chromatographie d’exclusion de taille ultérieure. Le polissage de la purification sur une colonne d’exclusion de taille donne de bons résultats, mais, en raison par exemple des volumes de chargement limités, il est moins flexible en matière d’évolutivité. Une approche différente, publiée par Kiss et coll.²⁰, décrit la purification des protéines étiquetées par la colonne d’affinité Ni^{2 comme} la première étape de purification, suivie d’un clivage enzymatique pour enlever l’étiquette et d’autres étapes de purification. Contrairement aux études précitées^19,20, la protéine produite telle que décrite dans ce protocole est déterminée pour des expériences sur les cellules immunitaires. Par conséquent, la contamination résiduelle d’endotoxine de la culture bactérienne est un défi. Bien que différentes approches pour l’élimination de l’endotoxine ont été décrites jusqu’à présent, il n’existe aucune méthode uniforme qui fonctionne aussi bien pour une solution de protéines donnée^21,22.

En résumé, notre protocole combine les avantages d’une expression sans étiquette dans un système bactérien avec l’élimination efficace de l’endotoxine et un rendement élevé de protéines pures.