В этом протоколе лимфоциты помещаются в верхнюю камеру системы трансмиграции, отделенную от нижней камеры пористой мембраной. Хемокин добавляется в нижнюю камеру, что индуцирует активную миграцию вдоль градиента хемокина. После 48 ч лимфоциты учитываются в обеих камерах для количественной оценки трансмиграции.
В этом случае мы представляем эффективный метод, который может быть выполнен с помощью базовых лабораторных навыков и материалов для оценки лимфоцитов хемокинетического движения в системе экс-виво-трансмиграции. Группа 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) и CD4T помощник клетки были выделены из селезенки и легких куриного яичного овальбумина (OVA) оспаривается BALB / c мышей. Мы подтвердили выражение CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2, сравнительно. CCL17 и CCL22 являются известными лигандами для CCR4; Поэтому, используя этот метод экс-виво-трансмиграции, мы изучили CCL17– и CCL22-индуцированное движение CCR4и лимфоцитов. Для установления градиентов хемокина, CCL17 и CCL22 были помещены в нижнюю камеру системы трансмиграции. Изолированные лимфоциты затем были добавлены в верхние камеры и в течение 48 ч период лимфоциты активно мигрировали через 3 мкм поры к хемокину в нижней камере. Это эффективная система определения хемокинетики лимфоцитов, но, понятно, не имитирует сложности, обнаруженные в микросреде органов in vivo. Это одно ограничение метода, который может быть преодолен путем добавления на месте изображения органа и лимфоцитов в исследовании. В отличие от этого метода является то, что может быть выполнена начального уровня техник на гораздо более экономически эффективным и в том, что такое живая визуализация. Как терапевтические соединения становятся доступными для повышения миграции, как и в случае опухоли инфильтрации цитотоксических иммунных клеток, или ингибировать миграцию, возможно, в случае аутоиммунных заболеваний, где иммунопатология вызывает озабоченность, этот метод может быть использован в качестве инструмент скрининга. В целом, метод эффективен, если хемокин интереса последовательно генерации хемокинетии на статистически более высоком уровне, чем контроль средств массовой информации. В таких случаях также может быть определена степень торможения/усиления данным соединением.
Этот оригинальный метод трансмиграции был представлен Стивен бойден в 1962 году в журнале экспериментальной медицины1. Многое из того, что мы знаем о химоксике и хемокинетике, было бы невозможно без развития Бойденской камеры. До открытия первого хемокина в 1977 году, ex vivo трансмиграции системы были использованы, чтобы узнать о сыворотки-факторов, которые могли бы остановить клеточное движение в макрофагах при одновременном усилении подвижности клеток в нейтрофилов1,2. Массивное богатство знаний было разработано в отношении миграции иммунных клеток, и на сегодняшний день, 47 хемокины в настоящее время обнаружены с 19 соответствующих рецепторов3,4. Кроме того, множество ингибиторов /усилителей этих хемокиновых путей претерпели развитие в терапевтических целях5,6,7,8. Многие из этих соединений были протестированы в аналогичных камерах трансмиграции, чтобы понять прямое взаимодействие между соединениями и иммунной реакции клеток к данному хемокину9.
Трансмиграция, или диапедез, в воспаленные ткани является важным процессом для здорового воспалительного ответа на ясную инфекцию10,11. Камера Бойдена, трансмиграционная система или трансвелл-аппарат, как правило, состоят из двух камер, разделенных пористой мембраной1,12. Нижняя камера чаще всего содержит средства, содержащие хемокин интерес, в то время как лейкоциты помещаются в верхней камере. Размер поры в мембране может быть выбран в зависимости от размера клетки интереса. Для этого проекта мы выбрали пористую мембрану площадью 3 мкм, так как лимфоидные клетки имеют размер 7-20 мкм в зависимости от стадии клеточного развития. Этот размер пор гарантирует, что эти клетки не пассивно падают через поры, но что они активно мигрируют в ответ на градиент хемокина.
Основным преимуществом этого протокола является его рентабельность. Инвиво трансмиграция трудна, потому что она требует обширной подготовки в области обращения с животными и хирургии, и часто включает в себя мощную микроскопию, которая не всегда доступна исследователю. Экономически эффективный скрининг соединений, которые, как считается, усиливают или подавляют трансмиграцию, может быть выполнен до создания in vivo изображений. Поскольку система трансмиграции жестко контролируется, клетки могут быть обработаны сначала затем добавлены в трансвелл аппарат, или, наоборот, хемокин может рассматриваться сначала с ингибитором хемокина, а затем клетки, добавленные в трансвелл аппарата. Наконец, эндотелиальные клетки и/или белки мембраны в подвале могут быть добавлены в нижней части вставки трансуэлла за 1-2 дня до эксперимента по трансмиграции, чтобы понять, как эти барьерные клетки существуют в химиокинетике. Опять же, эти манипуляции системы обеспечивают мощное средство определения важной информации об эффективности данного соединения до более сложных исследований in vivo.
Использование системы камер ы трансмиграции является эффективным способом оценки подвижности лимфоцитов в различных условиях in vivo и in vitro12,13,14. В этом мы описываем оптимизированный метод оценки реакции экзиво-лимфоцитов к хемокины в камере трансмиграции. В этом примере эксперимента, CD4и Т-клеток и группы 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) были изолированы от мужчин и женщин, BALB /c мышей после ova-аллерген воздействия. Была выдвинута гипотеза о том, что CCR4и CD45– Lineage- (LIN-) ILC2 от аллергенов-проблемных мышей будут мигрировать более эффективно к CCL17 и CCL22, чем CCR4и CD4и T клетки-помощники. CCL17 и CCL22 являются хемокины обычно производятся дендритных клеток и макрофагов М2 (аллергический) фенотип, среди других клеток, в аллергии15,16. CCL17 и CCL22 можно рассматривать как биомаркеры аллергического воспаления, поскольку они легко обнаруживаются в легких во время обострений дыхательных путей16,17,18. Важно отметить, что выражение CCR4 повышено по сравнению с необработанным контролем, как показано в биоинформатичных данных, полученных из ILC2, изолированных от домашней пыли клеща обработанных животных, и аналогичным образом ILC2 от наивных животных, обработанных ex vivo с IL-33 ( аллерген-сопродвигая врожденный цитокин) upregulates CCR419,20. Кроме того, согласно данным для ILC2 в базе данных Проекта иммунологического генома (www.immgen.org), CCR4 mRNA высоко выражен в этих врожденных иммунных клетках. На сегодняшний день мало что известно о торговле ILC2 в тканях, но вполне вероятно, что ILC2 и CD4– Т-клетки используют аналогичные хемокины и рецепторы для хемотаксиса и хемокинетики, поскольку они выражают аналогичные транскрипционные факторы и рецепторы. Таким образом, мы сравнили CCL17 по сравнению с отзывчивостью CCL22, iLC2 и CD4и T лимфоцитов, как от мужчин, так и от женщин, с ova-challenged животных.
В этом виде мы представляем устоявшийся метод оценки миграции лимфоцитов, индуцированной хемокином, в системе трансмиграции ex vivo. Есть несколько критических шагов в протоколе, первый из которых является проверка экспрессии правильного рецептора хемокина на иммунных клетках в экспери…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована Американской ассоциацией легких (K.J.W.), Фондом Мемориала Евгения Кенни, присужденным T.A.W. и K.J.W., щедрой поддержкой стартапа от Университета штата юта для K.J.W., и наградой Департамента по делам ветеранов T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. является лауреатом премии научно-исследовательской карьеры (IK6 BX003781) от Департамента по делам ветеранов. Авторы хотят отметить редакционную помощь от г-жи Лизы Чудомелько. Авторы благодарят ядро ЦИтометрии потока UNMC за их поддержку в сборе данных цитометрии потока, генерируемых для этой рукописи.
0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |